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『肆』 FIREDEP是什么意思

FIREDEP
=fire department

na.(=fire brigade)
消防局；消防队；消防部门
例句筛选
1.
With a cellphone the men reached the Fire Department.
他们用手机联系上了消防部门。

2.
Keep a level head and phone the Fire Department.
保持冷静，打电话给消防署。

『伍』 G.NA资料

G.NA|（최지나，崔智娜或崔志娜）
韩国CUBE Entertainment公司歌手、演员
1987年9月13日出生，代表作品包括歌曲《我会过得很好》、《Kiss me》、《loving you》、《supa solo》、《如果有恋人的话想做的事》等。

中文名： 崔智娜
外文名： 최지나
别名： 崔志娜
国籍： 韩国
出生日期： 1987年9月13日
职业： 歌手、演员
经纪公司： CUBE Entertainment
代表作品： 《我会过得很好》
名字：崔智娜
出生地：加拿大 五少女
身高/体重：169CM/50KG
星座：处女座
出道：2010年7月15日 (Mnet countdown 出道舞台)
练习时间：5年
曾经公司：GOOD Entertainment / JYP Entertainment
曾经组合：五少女 [UIE（After School）、杨智媛（T-ara一期成员，已退团）、金瑜斌（Wonder Girls）、全孝盛（Secret）
个人特色：甜美声音、拥有完美S.line无修正名品身材 粉丝名称：G. NI (genie)
粉丝名称意义：要帮助G.NA完成她的梦想，请大家成立一个令人惊豔的歌迷俱乐部

G. NA 从业经历

2005年，GNA参加GOOD Entertainment举办的battle shinhwa选秀，从而开始练习生活。
2007年，与杨智媛、UEE、金瑜斌和全孝盛五人，组成“五少女”组合，拍摄“MTV出道实录”，但由于公司资金原因组合并没有正式出道。
2008年，与金瑜斌一起转到JYP Entertainment，在美国接受训练准备出道。
2009年底，转到CUBE Entertainment，重新回到韩国训练，积极准备solo出道。
2010年1月，作为4minute泫雅《Change》的伴舞出现在音乐节目中。同月参加CUBE Entertainment的showcase，展现舞蹈实力。
2010年7月5日，推出数码单曲《如果有恋人的话想做的事》，与Rain合唱，标志着GNA正式出道
2010年7月14日，发行迷你专辑《Draw G's First Breath (EP)》 2011年1月18日，发行正规一辑《Black & White》。

『陆』 求合金装备3金手指。

http://www.yesky.com/136/1880136.shtml

.....

是金手指.......

『柒』 质粒抽提原理

实验原理
提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。[1]

碱裂解法

人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

质粒抽提
质粒抽提

原理
其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜（超滤柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ

葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。

溶液Ⅱ

此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。

溶液Ⅲ

溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上

质粒抽提步骤
Ⅰ.使用质粒提取试剂盒提取质粒时请参考具体试剂盒的操作说明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin（质粒提取盒）。

Ⅱ.碱裂解手提法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

1：接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。

2：37℃振荡培养过夜。

3：取1.5ml菌体于Ep管(离心管)，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4：加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。

5：加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

6：加入0.15m1预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

7：以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8：加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.

9：以10，000rpm离心20min，弃上清。

10：用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11：待沉淀干燥后，溶于50ulTE缓冲液中（或60℃温育去离子水）

抽提窍门
1：加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。

2：洗脱时60℃温育（Ellution Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。

3：若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培养基质粒得量高

4：菌体应彻底悬浮 ， 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

5：加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。

6：中和的操作 ，在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。

注意事项
降低RNA残留的方法

RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase。

降低gDNA残留的方法

gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。

降低蛋白质残留的方法

蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

降低质粒Nick的方法

细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比前两者大。

降低变性超螺旋的方法

理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)

关于质粒多聚体

QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。

提高得率的方法

利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒（如pUC19）的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。

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『玖』 翻译死神的EP:LIFE LIKE A BOAT

Nobody knows who I really am
I never felt this empty before
And if I ever need someone to come along
Who's gonna comfort me, and keep me strong

We are all rowing the boat of fate
The waves keep on comin' and we can't escape
But if we ever get lost on our way
The waves would guide you thru another day

远くで息をしてる 透明になったみたい
暗暗に思えたけど 目隠しされてただけ

祈りをささげて 新しい日を待つ
鲜やかに 光る海 その果てまで

Nobody knows who I really am
Maybe they just don't give a damn
But if I ever need someone to come along
I know you would follow me, and keep me strong

人の心はうつりゆく 抜け出したくなる
つきはまた新しい周期で 胸を连れてく

And every time I see your face,
the oceans leap up to my heart
You make me wanna strain at the oars,
and soon I can't see the shore

Oh I can't see the shore..
When will I see the shore?

I want you to know who I really am
I never though I'd feel this way towards you
And if you ever need someone to come along
I will follow you, and keep you strong

旅はまた続いてく 穏やかな日も
つきはまた新しい周期で 胸を照らし出す

祈りをささげて 新しい日を待つ
鲜やかに 光る海 その果てまで

And every time I see your face,
the oceans leap up to my hert
You make me wanna strain at the oars,
and soon I can see the shore

运命の舟を漕ぎ 波は次から次へと私たちを袭うけど
それも素敌な旅ね どれも素敌な旅ね

=========================================================

Nobody knows who I really am
I never felt this empty before
And if I ever need someone to come along
Who’s gonna comfort me and keep me strong?

We are all rowing the boat of fate
The waves keep on coming and we can’t escape
But if we ever get lost on our way
The waves will guide you through another day

Tooku de iki o shiteru
Toome ni natta mitai
Kurayami ni omoeta kedo
Mekaku shisareteta dake

Inori o sasagete
Atarashii hi o matsu
Asayaka ni hikaru umi
Sono hate made e

Nobody knows who I really am
Maybe they just don’t give a damn
But if I ever need someone to come along
I know you will follow me and keep me strong

Hito no kokoro wa utsuri yuku
Mukedashitaku naru
Tsuki wa mata atarashii shuuki de
Fune o tsureteku

And every time I see your face
The oceans heave up to my heart

You make me wanna strain at the oars
And soon I can see the shore

Ah, I can see the shore?
When will I see the shore?

I want you to know who I really am
I never thought I’d feel this way towards you
And if you ever need someone to come along
I will follow you and keep you strong

Tabi wa mada tsuzuiteku
Odayaka na hi mo
Tsuki wa mata atarashii shuuki de
Fune o terashiasu

Inori o sasagete
Atarashii hi o matsu
Asayaka ni hikaru umi
Sono hate made

And every time I see your face
The oceans heave up to my heart
You make me wanna strain at the oars
And soon I can see the shore

Unmei no mune o kogi
Nami wa tsugi kara tsugi e to
Watashitachi o osou kedo
Sore mo suteki na tabi ne
Dore mo suteki na tabi ne

感谢洁呓~` 提供中文翻译

没有人知道我是什么模样
我以前从为感到如此空荡
如果我需要有人来陪伴
谁会安慰我并让我更加坚强

我们都在命运之湖上荡舟划桨
波浪起伏着而我们无法逃脱孤航
但是假使我们迷失了方向
波浪将指引我们穿越另一天的曙光

在遥远的地方呼吸着 仿佛变成透明一般
还以为是周遭的黑暗 却只是被蒙住了双眼

虔诚地祈祷着 期待新的一天到来
直到那闪耀着亮丽光芒的大海边际

没有知道我究竟是什么模样
或许他们并不会指责我有些荒唐
如果我需要有人来陪伴
谁会安慰我并让我更加坚强

想从不断变迁的人心中挣脱
又一轮阴晴圆缺的月亮 牵引着我向前

想从不断变迁的人心中挣脱
又一轮阴情圆缺的月亮 牵引着我向前

每一次我看到你的脸庞
海洋奋力托起我的心脏
你令我在荡桨时感到紧张
转眼间我已经看到岸的彼方

啊，我能看到岸的彼方？
当我坏着这种强烈的渴望？

我希望你能知道我真正的模样
我从未想过我将要追寻你远去的地方
如果我需要有人来陪伴
我将追随你并让我更加坚强

就算平淡安稳的日子里 旅行也依然持续
又一轮阴情圆缺的月亮 照亮了我的身影

虔诚地祈祷着 期待新的一天到来
直到那闪耀着亮丽光芒的大海边际

荡起命运的小舟
虽然海浪一波一波地袭来
这次仍然是美好而奇妙的旅行
每次都是美好而奇妙的旅行

『拾』 吸血鬼骑士 OP EP

第一季OP
曲名：ふたつの鼓动と赤い罪
アーティスト：ON／OFF
akaku akaku akaku yurete
yume no yume no hate e
mou nandomo akirametewa oshikorosu tabi
yukiba no nai kanjyou ga me wo samashiteku
kegare no nai sono hohoemi zankoku na hodo
tooi sonzai da to wakaru yo
kienai kizu kokoro mushibamu dake nanoni
yami no naka ni ima mo yadoru
omoi wo osaekirenai
akaku akaku akaku yurete
yume no yume no hate e
deatte shimatta unmei ga mawaridasu
dare mo dare mo shiranai himitsu
ochite ochite ochite mou modorenai
tsumi wo kizandemo kitto
赤く赤く赤く揺れて
梦の梦の果てへ
离れられない
もう何度も谛めては押し杀すたび
行き场のない感情が目を覚ましてく
汚れのないその微笑み残酷なほど
远い存在だとわかるよ
愈えない伤 心蚀むだけなのに
暗の(中に)今も(宿る)想いを抑え切れない
赤く赤く赤く揺れて
梦の梦の果てへ
出逢ってしまった运命が廻り出す
谁も谁も知らない秘密
堕ちて堕ちて堕ちて
もう戻れない 罪を刻んでも きっと
孤独の渊歩きながら救われていた
どんな时も変わらないリアルな瞳
でも光が眩しいほど生まれる影は
深く色浓く忍び寄るよ
ふたつの鼓动 まるで合わせ镜のように
似てる(けれど)违う(痛み)无限に続いていく
赤く赤く赤く燃えて
すべてすべて消して
叶うことのない幻が动き出す
强く强く儚い夜を
超えて超えて超えて
逃れられない 罪に溺れても きっと
赤く赤く赤く揺れて
梦の梦の果てへ
出逢ってしまった运命が廻り出す
谁も谁も知らない秘密
堕ちて堕ちて堕ちて
もう戻れない 罪を刻んでも きっと
おわり
血红，血红，血红摇晃地，
走向幻想梦境的尽头。
已经放弃了无数次，
每次压抑着自己，
无处可去的感情慢慢觉醒。
看见那微笑，纯洁无邪，又是如此残酷，
远远的，感到它的存在。
虽然无法愈合的伤口，侵蚀着内心，
黑暗中，如今还潜藏着无法抑制的思念。
血红，血红，血红摇晃地，
走向幻想梦境的尽头。
我们邂逅了，命运之轮开始旋转，
谁也不知晓的秘密，
不断陷落，陷落，陷落。
就算刻上无法抹去的罪过，也一定无怨无悔。

第一季ED
曲名：Still Doll
歌：分岛花音
曲; mana SAMA(佐藤学-moi dix mois的吉他手+队长)
Hi Miss Alice.
あなた 硝子(ガラス)の眼(め)で どんな梦(ゆめ)を
见(み)られるの？
魅(み)入(い)られるの？
またあたし
こころが裂(さ)けて
流(なが)れ出(で)る
缮(つくろ)った
隙间(すきま)に刺(さ)さる
记忆(きおく)たち
Hi Miss Alice.
あなた 果実(かじつ)の口(くち)で
谁(だれ)に爱(あい)を
投(な)げているの？
叹(なげ)いているの？
もうあたし
言叶(ことば)を纺(つむ)ぐ
舌(した)の热(ねつ)
冷(さ)め切(き)って
爱(め)でるお歌(うた)も
歌(うた)えない
still you do not answer
原文中文翻译：
Hi Miss Alice
你那玻璃的双瞳究竟会看见怎样的梦境呢？
怎样的梦境呢？
再次，我的心裂痕延展、鲜血四溢
从那修补的缝隙间刺入记忆的利刃
Hi Miss Alice
你那果实般甜美的朱唇又在为谁咏叹爱语呢？
为谁咏叹呢？
已然，我那编织妙语的炙热唇舌
早已冰冷得连心爱的乐章也无法吟唱出口
Still, You Do Not Answer
罗马拼音：
Hi miss Alice
a na ta ga ra su no me de
do n na yu me o
mi ra re ru no
mi ra re ru no
ma da a ta shi
ko ko ro ga sa ke te
na ga re de ru
tsu ku ro o ta
su ki ma ni sa sa ru
ki o ku ta chi
Hi miss Alice
a na ta ka ji tsu no gu chi de
da re ni a i o
na ge i te ru no
na ge i te ru no
mo u a ta shi
ko to ba o tsu mu gu
shi ta no ne tsu
sa me ki i te
me de ru o u ta mo
u ta e na i
Still, you do not answer