糖苷水相純化技術

① 怎樣從酵母中提取蔗糖酶

菌體自溶法/機械破碎法/超聲波破碎法

② 雙水相萃取技術的應用

雙水相萃取技術已廣泛應用於生物化學、細胞生物學、生物化工和食品化工等領域，回並取得了答許多成功的範例，主要是分離蛋白質 ，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。
此外雙水相還可用於稀有金屬/貴金屬分離，傳統的稀有金屬/貴金屬溶劑萃取方法存在著溶劑污染環境，對人體有害，運行成本高，工藝復雜等缺點。雙水相技術萃取技術引入到該領域，無疑是金屬分離的一種新技術。
目前，用此法來提純的酶已達數十種，其分離過程也達到相當規模，I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4體系從Trichoderma koningii發酵液中分離純化β-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數33；

③ 求實驗室胡蘿卜多糖提取方案，要具體的條件步驟

由於胡蘿卜主要的多糖類型為果膠，因此根據果膠的特殊性質可以依次採用水提、CDTA(或
EDTA)、弱鹼螯合等方式從胡蘿卜中提取，分別得到水溶性果膠、CDTA
螯合果膠和弱鹼螯合果膠等不同性質的多糖，同時可採用超聲、微波、酶解等方法輔助提取，提高多糖得率。
不同提取方法獲得胡蘿卜多糖的相對分子質量存在一定差異，一般都小於50萬， 有少數報道胡蘿卜多糖相對分子質量超過了50 萬。

④ 基因組dna提取的原理

1.溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。
EDTA：
(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基);
(2)EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。
2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6， 因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。
SDS：
SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：
(1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。
(2)解聚細胞中的核蛋白。
(3)SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中 (用RNase去除RNA時)受到干擾。
3. 溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：
NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性， 使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合.

⑤ 虎眼萬年青多糖的分離純化及性質研究

這是我轉載的，不知對你有沒有幫助
1 前言

多糖是存在於自然界的醛糖和（或）酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有機體必不可少的成分，它與維持生命的種種生理機能有著密切的聯系。近年來，植物、海洋生物及菌類等來源的多糖已作為有生物活性的天然產物中的一個重要類型出現，各種多糖所具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相繼被發現。多糖具有復雜的結構，這是因為它具有許多不同單糖殘基、不同的連接位置和不同類型的糖苷鍵，能形成具有不同的構象、不同的相對分子質量，以及鏈內和鏈間氫鍵的二級結構。

對多糖的研究，最早是在20世紀40年代，但其作為廣譜免疫促進劑而引起人們的極大重視則是在60年代,經過40餘年的不斷發展,人們對多糖這一類重要生命物質產生了新的認識, 使這一學科成為目前生命科學中研究最活躍的領域之一[1]。越來越多的研究發現多糖對人體具有極大的利用價值,按其來源可分為三類: 動物多糖、植物多糖和微生物多糖。其中植物多糖如人參、黃芩、刺五加、蘆薈等所含多糖均具有顯著的葯用功效, 如免疫增強作用, 抗腫瘤作用,抗輻射用等。據文獻[2]報道,已有近100種植物的多糖被分離提取出來。這類多糖來源廣泛且沒有細胞毒性, 應用於生物體毒副作用小,因此對植物多糖的研究已成為醫葯界的熱門領域。

多糖(polysaccharides,PS)又稱多聚糖。其存在於動物、高等植物、微生物(細菌和真菌)及海藻等機體中。多糖具有復雜、多方面的生物活性和功能,可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，如多糖能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系統疾病，甚至能抗 AIDS 病毒[3]；還具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂作用；促進核酸與蛋白質的生物合成作用；能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老，而且多糖作為葯物其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們的極大興趣。多糖分子量在數萬或數百萬，植物多糖包括澱粉、纖維素、葡聚糖(如香菇多糖)、果聚糖樹膠、粘液質、粘膠脂(如瓊脂)等，其中有些免疫激活多糖是癌細胞抑制劑，但特異性較差。20 世紀80 年代，德國的Franz G 等研究組最為活躍，證明許多植物多糖、真菌多糖有抗腫瘤活性。這包括已用於臨床的香菇多糖(Lentinan)、雲芝多糖(Ps-K，Krestin)、豬苓多糖等。

多糖在醫葯上還是一種很好的佐劑。近年來又發現多糖的糖鏈在分子生物學中具有決定性作用。此外它還能控制細胞的分裂和分化，調節細胞的生長和衰老。多糖在食品工業、發酵工業及石油工業上也有著廣泛的應用。越來越多的植物多糖成分獲得了新的開發，其在食品領域中的應用價值得到了發展和證實，為食品工業的快速發展注入了新鮮的活力。近年來，隨著人們對多糖及糖結合物在生命科學中作用的認識，以及多糖研究技術的迅速發展和改進，多糖研究異軍突起，國際科學界視多糖的研究為生命科學的前沿領域，甚至提出21世紀是多糖的世紀[4]。許多植物多糖具有免疫調節活性，能夠增強機體巨噬細胞、淋巴細胞等免疫系統的功能及激活或促進抗體、補體的生成和干擾素的誘生；多糖也可以用於糖尿病的防治，促進胃潰瘍癒合和修復，具有抗輻射、降血脂等多種功效。因此，多糖及其衍生物作為生物效應調節劑而成為近年來天然葯物的研究熱點之一。

因此，對多糖的分離純化研究具有重要的現實意義。本篇論文主要研究醇沉分級、柱層析等。

2實驗部分

2.1主要試劑與儀器

Sephadex DEAE 系列，Pharmacia公司

唾液澱粉酶，美國Sigma公司

SDS凝膠

Coomassie Blue試劑

β-葡萄糖基-Yarive試劑

其它試劑均為分析純

PD 10 柱， Amersham harmacia Biotech 公司

自動流分收集器

RE52CS型旋轉蒸發儀，上海醫械專機廠

6010型紫外-可見分光光度計，Angel上海分析儀器公司

2690型高效液相色譜儀，美國Waters公司
2.2 實驗方法fficeffice" />

2.2.1 除澱粉

將虎眼萬年青粗多糖配成20%水溶液，經唾液澱粉酶37℃酶解除澱粉。

2.2.2 除蛋白

Sevage法除蛋白質：樣品水溶液按4：1體積比加入氯仿、正丁醇（比例5：1），離心法（10000rpm、20min）除去形成凝膠狀的蛋白質，反復多次（3次）至蛋白質除盡為止。除蛋白的效果用茚三酮反應檢測，結果呈陰性（或雙縮脲試驗）；同時在200～280 nm處測定除蛋白後樣品的紫外吸收曲線來檢測效果，除掉蛋白質的多糖溶液在260～280nm的紫外吸收峰消失，說明多糖不含有蛋白。

2.2.3 除鹽

將以上處理液採用半透膜，通過逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質，用蒸餾水透析48h。

2.2.4 醇沉分級

粗多糖15g+250mlH2O加熱溶解，冷卻，加入40％乙醇沉澱，攪拌，放置，抽濾，得沉澱（OC-1），用40％的乙醇共沉澱3次，合並濾液，濃縮。

取上濃縮液用60％乙醇沉澱，攪拌溶解，放置，抽濾，得沉澱（OC-2），濾液再用60％的乙醇共沉澱3次，合並沉澱。得濾液（60％醇溶液）（OC-3）。

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2.2.5柱分離fficeffice" />

60％乙醇沉澱（OC-2）溶於熱水後與Sephadex DEAE樹脂在一個燒杯中混合。平衡後，將樹脂置於分液漏斗中並用0.5mol/L NH4HCO3溶液洗滌，分成兩個組分：0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脫液（OC-2－1）和結合在樹脂上的組分（OC-2－2）。

0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脫液（OC-2－1）蒸干後溶解在水中，上DEAE柱（4.5×12.0），然後用0.2mol/L NH4HCO3溶液等度洗脫，測定各洗脫液的OD值，用收集管數對OD值繪制洗脫曲線。將同一峰的組分合並，產生7個組分：OC-2－1－a(未結合部分)，OC-2－1－b, OC-2－1－c, OC-2－1－d, OC-2－1－e, OC-2－1－f(1mol/L NH4HCO3洗脫液), OC-2－1－g(1 mol/L乙酸鈉洗脫液)。

上述不同組分用UV分光光度計在215和280nm波長下測定吸光度OD值。

減壓60℃以下將各組分蒸干，然後用PD 10柱（葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25M）除去鹽和小分子。

用60％醇沉部分熱水溶解上DEAE樹脂柱，用不同濃度的NH4HCO3：0.2M、0.25M、0.4M、0.5M、1.0M

⑥ β-葡聚糖酶純化、性質及編碼基因

10.2.2.1 β-葡聚糖酶的純化和酶學性質

葡聚糖酶按照水解支鏈的類型分為a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶。a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶按照作用的糖苷鍵類型的不同，又可分為β（或a）-1，2葡聚糖酶，β（或a）-1，3葡聚糖酶，β（或a）-1，4葡聚糖酶和β（或a）-1，6葡聚糖酶。β-葡聚糖酶屬於水解酶類，按照水解的作用方式（水解發生在胞外或是胞內）可以分為內切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶兩種類型。β-葡聚糖酶活性能力是根據水解最後的產物是單聚體還是二聚體而定義的。內切β-葡聚糖酶的活性通常比外切β-葡聚糖酶的活性要高一些，並且內切β-葡聚糖酶形成的低聚糖要多於外切β-葡聚糖酶。對β-葡聚糖酶尤其是β-1，3葡聚糖酶有較多的文獻報道，β-1，6葡聚糖酶在微生物中很少被發現。大部分的外切葡聚糖酶表現有β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶的活性（Yamamoto et al.，1975；Vazquez de Aldana et al.，1991）。

木霉和粘帚霉的β-葡聚糖酶包括內切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶。由於每種酶都有不同的成分、性質和Mr值，阻礙了這些酶之間的協同作用和調節作用（表10.2）。因為酶所含有的不同成分是來源於不同的菌株，所以不能確定這些不同的酶是不同基因的產物還是基因在翻譯之後修飾的產物。因為產酶條件的不同，所以估算Mr值也有很多不同的方法。試驗顯示哈茨木霉CECT內切β-1，3葡聚糖酶與內切β-1，6葡聚糖酶的抗體與其他木黴菌株產生的β-葡聚糖酶會發生凝集作用（Rey et al.，2001），表明木霉中至少存在這兩種酶。不同的β-葡聚糖酶編碼基因的分離是確定木霉產生多少種β-葡聚糖酶的前提條件。

大部分研究採用色譜分析技術來提純β-葡聚糖酶。Dubordieu等（1985）從哈茨木霉的商品化酶制劑中分離到兩個外切β-1，3葡聚糖酶、1個內切β-1，6葡聚糖酶和1個β-葡聚糖酶單體。在這兩個外切β-1，3葡聚糖酶中，一個酶的酶活性主要是由分子量大小為40kDa的蛋白構成的，此酶能降解灰霉病的β-1，3 葡聚糖和β-1，6葡聚糖。利用色譜分析法也從鉤狀木霉粗提物中分餾到了兩種酶，一種是澱粉葡萄糖苷酶，無葡聚糖酶活性，一種是β-葡聚糖酶，沒有澱粉葡萄糖苷酶活性。β-葡聚糖酶是由兩個外切β-1，3葡聚糖酶和一個內切β-1，3葡聚糖酶組成的，它們的等電點pI分別為5.25，4.95和4.20（Thomas et al.，1983）。1977年，Bielecki和Galas從鉤狀木霉的另一個商品化制劑（名叫「Onozuka」）中分離純化出兩個β-1，3葡聚糖酶：一個是酸性但沒有裂解細胞壁活性的水解海帶多糖（β-1，3 葡聚糖），另一個對釀酒酵母有細胞壁裂解活性（Bielecki et al.，1977）。De Vies和Wessels（1973）從一株寄生在真菌中的綠色木霉里分離純化出一種外切β-1，3葡聚糖酶，但是文章里僅僅描述了這個酶產生原生質體的能力。Tang-arone等（1989）比較了雙孢菇糖提取物里長枝木霉產生的兩種不同的β-葡聚糖酶。研究人員將從鉤狀木霉中分離的海帶多糖稀釋80倍後，發現其Km值低於擔子菌細胞壁產生的β-葡聚糖酶的Km值，認為海帶多糖中葡聚糖酶的作用影響器官的形成（Griffin，1994）。

近年來研究最多的是哈茨木霉CECT2413在真菌寄生物中產生的β-葡聚糖酶。大部分研究是採用等電法從哈茨木霉中分離一種基本同工酶和至少三種酸性同工酶（De la Cruz et al.，1995b）。通常說的β-1，3葡聚糖酶BGN13.1是以石耳多糖為介質採用吸附法純化得到的純物質。BGN13.1的分子量是78kDa且不能被糖化。這種酶在釀酒酵母細胞壁和海帶多糖細胞壁中表現出最大的酶活性（海帶多糖的Km值是3.3mg/mL）。這個酶屬於內切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1 這個酶只對木霉具有專一性，因為抗血清反應表明：這個酶與從真菌和植物中提取的β-葡聚糖酶沒有發生交叉反應。同樣的，這個酶與從哈茨木霉中提取的β-1，3葡聚糖酶也不發生抗血清反應。哈茨木霉CECT2413至少產生兩種內切 β-1，6 葡聚糖酶，純化後大小分別為51kDa和43kDa（De la Cruz et al.，1995b）。還有研究將一些木霉（綠色木霉、長枝木霉、里氏木霉、康寧木霉、綠木霉）的培養物採用Western進行雜交，雜交結果表明這些木霉在相同條件下都產生BGN16.2（Rey et al.，2001）。

從哈茨木霉培養物上清液中發現的多種葡聚糖酶具有不同的催化活性、分子量和基因特性。但是對這些酶是由單基因調控還是由多基因調控目前仍不確定。Noronha等（1996）發現了另一株哈茨木霉在寄生真菌細胞壁或在幾丁質平板上培養時均產生β-1，3葡聚糖酶。從這株哈茨木霉中純化到一個酸性的內切β-1，3葡聚糖酶，分子量是36kDa，對海帶多糖有水解活性。其他研究者描述哈茨木霉能產生兩個分子量為32kDa和78kDa的外切β-1，3葡聚糖酶（Kitamoto et al.，1993；Lorito et al.，1994），也有人從一株里氏木霉（Bamforth，1980）中發現了一個外切β-1，3 葡聚糖酶，分子量為70kDa。從哈茨木霉和里氏木霉中發現的這些β-1，3葡聚糖酶大多是外切酶，水解通常發生在β-1，3位置，很少發生在β-1，6位置。從哈茨木霉CECT2413 中克隆到兩個葡聚糖酶基因；一個是內切β-1，3葡聚糖酶，基因編碼的蛋白質大小為78kDa（表10.2）；另一個是內切β-1，6葡聚糖酶，基因編碼的蛋白質大小為43kDa。β-1，3葡聚糖酶基因的克隆表明了木黴菌株CECT2413主要具有β-1，3葡聚糖酶活性。該基因的克隆通過檢測純化蛋白的氨基酸序列得到。Southern雜交表明哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶基因都是bgn13.1的單拷貝，哈茨木霉基因所編碼的蛋白由728個氨基酸組成，優於N端的34個早前體氨基酸序列，該蛋白序列被一個KEX2肽酶分開，然後終止於KR（De la Cruz et al.，1995b）。在酵母里表達時，這個早前體氨基酸序列才被合成和分泌（Lora et al.，1995）。將早前體氨基酸序列和其他的β-葡聚糖酶進行氨基酸序列同源性比較，結果發現原先假定的活性部位能夠識別谷氨酸。但是沒有證據表明這個連接酶的分離同纖維素酶和葡聚糖酶一樣。在煙草Ⅰ類幾丁質酶中，帶有半胱氨酸的N末端對幾丁質的連接位點很重要，N末端的側鏈是9～10 bp長度的非完全正向重復序列。以上表明這些區域來自一個普通的原始基因且是經過轉化得到的（Shinshi et al.，1990）。通過放線菌的水平基因交換法明確了黃色粘球菌基因的結合位點和催化位點，這一方法被證明可行（Quillet，1995）。一些葡聚糖酶結合位點的轉座源可以解釋在一些菌中葡聚糖酶基因缺失的原因，例如木霉中β-葡聚糖酶基因的缺失。

將bgn13.1基因的序列與a或β-葡聚糖酶的基因序列進行同源性比較，結果發現同源性很低。因此確定這個基因編碼的蛋白代表了一類新的β-1，3葡聚糖酶。來源於細菌、酵母、絲狀真菌和植物的bgnl3.1線性序列的保守區域不同於其他來源的bgn13.1（De la Cruz et al.，1995b）。但是用玉米葉斑病的β-1，3葡聚糖酶基因就能檢測到限制性同源性。這也可以從60餘個葡聚糖酶基因的系統發育樹上看出限制性同源性。從一些文獻中也可以看出由 bgn13.1 形成的外群體和其他的 β-葡聚糖酶編碼基因（Barnett et al.，1991）或β-1，6葡聚糖酶編碼基因（De la Cruz et al.，1995b）在親緣關繫上比較遠。但是由bgn13.1形成的外群體和木霉纖維素酶的親緣關系比較近（表10.1）。

表10.2 從木霉中純化的葡聚糖酶性質

註：a為mg/mL；b為μmol葡萄糖/（min.mg蛋白質）；ND為未描述；Gn為葡萄糖鏈的長度。

哈茨木霉CECT 2413的胰蛋白酶純化後，根據其氨基酸序列設計兼並引物克隆了β-1，6葡聚糖酶的編碼基因。相反的，對哈茨木霉bgn13.1基因，Southern 雜交分析的結果表明存在3個相同的基因拷貝（Lora et al.，1995）。蛋白序列分析表明來自釀酒酵母（Muthukumar et al.，1993；San Segundo et al.，1993）的EXG1（分布在耐熱分生孢子里的外切β-1，3葡聚糖酶）和念珠菌的 SPR1（外切 β-1，3葡聚糖酶）有部分同源性（Chambers et al.，1993）。檢測其蛋白序列的保守區域，發現外切葡聚糖酶催化區域的來源和內切β-葡聚糖酶的來源一樣，且推測蛋白序列中含有糖基化基團。但是比較經En-doH處理後的蛋白Mr值和經 SDS-PAGE電泳後的蛋白遷移帶值，發現從哈茨木霉CECT2413中純化的第二個內切β-1，6葡聚糖酶內切肽序列幾乎沒有糖基化基團（De la Cruz et al.，1995a）。高雯等（2008）在哈茨木霉LTR-2中克隆出了內切β-1，3葡聚糖酶基因glu。該基因由2289個核苷酸殘基組成，含有一個開放閱讀框架，可以編碼762個氨基酸，翻譯後的氨基酸序列含有兩個 β-1，3葡聚糖酶的保守區 RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF。該基因與已發表的木霉β-1，3葡聚糖酶基因有較高的同源性，其中與哈茨木霉bgn3.1和綠木霉bgn13.1的同源性均達到93%以上。該序列已經提交GenBank，登錄號為EF176582。表10.3列出了目前已克隆的木黴菌葡聚糖酶基因。

10.2.2.2 β-葡聚糖酶的調控和功能

和其他的一些絲狀真菌一樣（Griffin，1994），木霉和粘帚霉（De la Cruz et al.，1993）也是通過誘導和代謝產生β-葡聚糖酶。問題是像β-1，3葡聚糖這樣的大分子是如何被催化和誘導的，答案仍然是未知的。人們根據生化和分子生物學方法對纖維素系統中酶的誘導和催化進行了推測，這兩種方法一直認為是附著分生孢子的外切葡聚糖酶首先攻擊了β-1，3葡聚糖分子（Kubicek et al.，1987 a；Kubicek et al.，1993）。菌絲體釋放的二糖進一步促進了葡聚糖酶的生物合成。生長在不同碳源中的綠木霉或生長在寄主細胞壁中的粘綠木霉的培養基上清液中都有β-葡聚糖酶活性、幾丁質酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性。幾丁質也能誘導長枝木霉（Tangarone et al.，1989）和玉米葉斑病菌（Schaeffer et al.，1994）產生β-1，3葡聚糖酶。

在自然界中真菌細胞壁中的幾丁質酶和葡聚糖酶經常同時產生，同時誘導幾丁質酶和葡聚糖酶的底物，而單個酶單獨出現的情況並不多見（Lorito et al.，1994；表10.4）。酶對底物的相對活性是多種多樣的，但是β-葡聚糖酶的最高活性是在寄主細胞壁中生長時產生的（Van Tilbura et al.，1993）。培養了8d的樣品做SDS-PAGE電泳，分析電泳結果表明胞外蛋白的出現原因是誘導機制，蛋白的失活、降解和所檢測到的酶活都是由於不同活性的酶在不同的作用時間誘導的結果（Van Tilbura et al.，1993）。在另外一些真菌中，酶失活的機理是由於內源蛋白的合成導致蛋白酶解和糖組成的轉移（Friebi et al.，1975；Santos et al.，1978b）。不同的酶被不同的真菌細胞壁誘導後被發現和木霉的寄生能力相關（Sivan et al.，1989）。然而Ridout等（1986）發現生長在離體細胞壁中的蛋白屬性不同於在植物病原真菌產生拮抗作用時產生的蛋白。

表10.3 已克隆的木黴菌葡聚糖酶基因

註：NCBI表示此行為從該網站獲取數據。

表10.4 哈茨木霉CECT2413在不同碳源培養基上培養時產生的水解酶活性

註：C.W.為細胞壁；B.c為灰葡萄孢菌；P.c為馬鈴薯晚疫病；R.s為立枯絲核菌；T.h為哈茨木霉。

（De la Cruz，et al.，1993）

對一些重要的β-葡聚糖酶已經研究的很詳細。De la Cruz等（1993，1995b）發現哈茨木酶CECT2413在不同的碳源上被幾丁質、黑麴黴多糖（a-1，3和a-1，4葡聚糖）、石耳多糖（β-1，6葡聚糖）、真菌細胞壁、葡萄糖脅迫等條件誘導以後能產生外切β-1，3葡聚糖酶和外切β-1，6葡聚糖酶（表10.4）。無論是RNA干擾還是蛋白質合成抑制酶的誘導，都離不開酶合成中的表達和調控。在很多菌株中（長枝木霉、綠色木霉、康寧木霉、里氏木霉和粘綠木霉）觀察到酶相似的表達和調控。在大多數情況下，當有2%葡萄糖存在的條件下一般能觀察到β-葡聚糖酶的活性（Rey et al.，2001）（表10.5）。

表10.5 在不同碳源條件下木霉產生的β-1，6葡聚糖酶的活性

註：Bot.為灰霉；P.spp為青黴；P.c.為馬鈴薯晚疫病；S.c.為釀酒酵母；C.W.為細胞壁。

（Rey et al.，2001）

然而，當不同的β-葡聚糖酶同工酶被單獨研究的時候就獲得了一組不同的調控模式（De la Cruz et al.，1995b）。在幾丁質、海帶多糖、石耳多糖存在的條件下檢測到四個同工酶，它們都是在真菌細胞壁胞外產生的內切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1的轉錄是由內切β-1，3葡聚糖酶基因編碼得到，而並非葡萄糖脅迫產生。在有2%葡萄糖存在的條件下能檢測到BGN13.1的活性（表10.6）。當在真菌細胞壁中生長時，雖然這個內切β-1，3葡聚糖酶單獨存在時不能產生透明水解圈，但是它能阻止病原真菌和其他的水解酶相結合。因為這個內切β-1，3葡聚糖酶的特殊誘導作用和裂解活性，這個酶被認為是木霉對抗一些病原真菌的拮抗酶，然而它在腐生植物里的作用還沒有被發現（De la Cruz et al.，1995b）。

表10.6 哈茨木霉CECT2413產生的兩種β-葡聚糖酶和兩種幾丁質酶在不同底物條件下的不同調控作用

註：N 為northern雜交實驗；W為western雜交實驗；A為凝膠活性；R.s.為R.solani；S.c.為S.cerevisiae；C.W.為細胞壁；ND為未做。

（De la Cruz et al.，1995b；Gelgado et al.，2000；Gelgado et al.，2002）

在有葡萄糖存在的條件下，哈茨木霉CECT2413的內切β-1，6 葡聚糖酶編碼基因可誘導細胞壁產生聚合物，從這個內切β-1，6葡聚糖酶的8000個基因里僅獲得了一個cD-NA基因，且mRNA的翻譯水平很低，說明該基因的表達很微弱（表10.6）。當內切β-1，6葡聚糖II濃度較高時（當濃度為25mg/mL時，抑制率為70%～80%），將它放在酵母細胞壁中培養，此酶能產生透明圈，而且這個酶能阻止其他真菌與其他裂解酶的結合（De la Cruz et al.，1995a）。

β-葡聚糖酶的調控規則如上所述，一些學者也研究了β-葡聚糖酶的構成。Del Rey等（1979）將綠木霉在葡萄糖培養基上培養，採用破壁提取法獲得了β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶。如果不破除細胞壁，要麼不能產生β-葡聚糖酶，要麼就是β-1，6葡聚糖酶的產量很低。作者認為這種現象表明這些β-1，6 葡聚糖酶和形態基因有關。Kubicek（1982）也支持上述觀點，他描述了擬康氏木霉和黃綠木霉β-1，3葡聚糖酶的構成。β-1，3葡聚糖酶的活性和培養基β-葡聚糖酶的釋放量有關。這表明β-1，3葡聚糖酶的形成與β-葡萄糖和β-葡聚糖酶之間的轉換有關。然而，在擬康氏木霉中和細胞壁結合的β-葡聚糖酶活性主要是由3種同工酶決定的，但是這三種酶的作用是相同的還是各不相同的至今尚不明確（Kubicek，1982）。在青黴菌中，與細胞壁結合的β-1，3葡聚糖酶Ⅱ和Ⅲ的作用是促進細胞壁的生長和延伸，而β-1，3葡聚糖酶I的作用是促進葡聚糖的流動和分生孢子的形成（Santos et al.，1978a，b）。綜上所述，酶與細胞壁的結合對形態基因的建成並非是必需的。里氏木霉細胞壁和血漿膜的最外層是β-葡聚糖酶，但是它的作用是水解纖維素（Cummings et al.，1996）。

真菌的β-葡聚糖酶有各種不同的作用，包括營養（表10.7）和抑真菌作用。哈茨木霉P1產的78kDa的β-1，3葡聚糖酶有抑真菌活性，它能幫助內切幾丁質酶和幾丁質-β-1，4殼聚糖酶阻止灰霉病孢子的萌發和萌發管的延長。當蛋白質濃度是10～20μg/mL時能徹底地抑制病原菌的孢子萌發和萌發管的延長。Clarkson（1992）描述了哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶的抑菌作用。另外，從綠木霉中分離的β-1，3葡聚糖酶和β-1，4葡聚糖酶能破壞真菌細胞壁的完整並導致細胞質滲漏（Jeffries et al.，1994）。

表10.7 不同的木霉和病原菌在雙重培養基上對峙培養的β-1，3和β-1，6葡聚糖酶活性

註：+為致病菌培養1～4d過度生長或死亡；±為培養4～10d；-為培養10d後病原菌不生長或不死亡。

（Rey et al.，2001）

β-葡聚糖酶是木霉和粘帚霉細胞壁的組分之一，如同葡聚糖裂解酶的作用一樣（De la Cruz et al.，1993，1995b）。目前仍不是很清楚它們的細胞壁是如何克服裂解酶的作用的。有一種解釋認為是酵母成分對外界失活而造成的（Adans et al.，1993；Manocha et al.，1988）。細胞壁結構組分的出現抑制了裂解酶。例如，a-葡聚糖鏈的可折疊性質使它能抵制裂解酶（Kuhn et al.，1990）。其他成分例如結構蛋白也能起到保護作用。Goldman等（1994）和Vasseur等（1995）分離了3個基因編碼的蛋白質，分子量大小分別為69kDa，37kDa和15.6kDa。假定15.6kDa蛋白的氨基酸序列在絲氨酸和丙氨酸的結構蛋白里也有，那麼就證明該葡聚糖能夠抑制水解酶。另外，黑色素的出現也為裂解酶提供了保護（Bull，1970）。

許多β-葡聚糖酶和真菌的自溶有關系。但是這些酶的重要作用還沒有完全被弄清楚。例如在細胞壁組分更新中的作用、細胞在營養缺乏條件下的生存、與殺菌劑相互作用干擾細胞壁的合成等方面。一些絲狀真菌在碳源受限的條件下形態基因發生改變，同時β-葡聚糖酶的一些裂解酶迅速增加都被認為是為β-葡聚糖酶提供能量。在一般的生長過程中，β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶在菌體自溶和細胞壁延伸時充當結構葡聚糖的角色（Santos et al.，1977，1978a，b）。

⑦ 總糖及還原糖提取分離與純化方法有哪些

1、採用間接法測定桔梗多糖的含量.運用蒽酮-硫酸法測定桔梗總糖(包括多糖和還原性的單糖)的含量,分別採用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)、間接碘
量法、菲林滴定法測定還原糖的含量.總糖含量與還原糖含量之差即為多糖的含量.三種方法測得的桔梗多糖的含量分別為95.55%、96.01%、
95.75%.結果顯示三種方法測得的值相近,但是綜合實驗成本、設備、操作及影響測定的因素等多方面考慮,選用蒽酮-硫酸法與DNS法相結合測定桔梗多
糖的含量.
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2、採用傳統的水煮醇沉法提取桔梗多糖,分別考察了提取溫度、提取時間、料液比、提取次數對桔梗多糖提取率的影響,在單因素實驗的基礎上採用了四因素三水
平正交試驗來優化桔梗多糖的提取工藝.正交試驗結果表明,桔梗多糖提取的最佳工藝條件為：提取溫度為80℃,提取時間為2h,提取次數為2次,料液比為
1：25.通過3次平行驗證實驗得出在該方案下桔梗多糖的提取率為42.51%.
\x09
3、採用Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3種方法分別對桔梗多糖進行脫蛋白研究,以蛋白脫除率和多糖損失率為衡量指標,結果顯示Sevag
法除蛋白效果較好,其工藝條件為：多糖：氯仿：正丁醇=25：5：1,劇烈振搖20min.脫色方法採用H2O2氧化法,脫色條件為：多糖
液：H2O2=4：1,以濃氨水或0.1%NaOH調pH值為8.8,37℃保溫12h.採用Sephadex G-25柱層析法脫鹽及小分子物質.
\x094、純化後的桔梗多糖採用DEAE-纖維素52進行分離主要得到三種組分：PGPN、PGPA1、PGPA3.三種組分經過Sephadex
G-100柱層析進一步分離後均得到單一對稱的洗脫峰.利用Sephadex
G-100柱層析、旋光度測定法、紫外分光光度法對三種多糖進行純度鑒定得出三種多糖都為均一的多糖,且都不含蛋白質和核酸.利用Sephadex
G-200柱層析測得三種多糖的分子量分別為10233、4677、23442.
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5、採用薄層色譜法(TLC)對桔梗多糖的單糖組成進行了分析,TLC圖譜顯示PGPN的單糖組成中含有果糖,還含有葡萄糖和半乳糖中的一種或者兩種皆
有；PGPA1是由半乳糖和果糖組成的；PGPA3是由半乳糖和木糖組成的.IR光譜顯示PGPN的單糖是由呋喃糖和吡喃糖共同組成的；PGPA1的單糖
也是由呋喃糖和吡喃糖共同組成的；PGPA3的單糖是由吡喃糖組成的,糖苷鍵類型為α-型,可能含有β-型糖苷鍵.1H-NMR圖譜顯示PGPN的糖苷鍵
類型均為α-型,PGPA1糖苷鍵類型均為β-型；PGPA3的糖苷鍵類型既有α型也有β型.

⑧ 黃酮類化合物的提取方法有哪些

1、醇提取法

黃酮類化合物提取最常用一種方法，常用的有機溶劑主要有乙醇、乙醚、甲醇和乙酸乙酯等，其中乙醇是最常用的。

2、微波提取法

微波提取技術又稱微波萃取技術，其最大的優點是耗能耗材少、無污染，尤其對特定的葯材提取具有高選擇性。

3、超臨界萃取技術

超臨界萃取是一種較廣泛使用的葯物提取、分離手段，其最大的優點是無有機溶劑殘留，保證了提取成分的100%純天然。

4、酶解法

酶解法是一種較好的輔助提取方法。酶具有高度的選擇性，因此對不同提取材料，選擇合適的酶對提取率影響較大。

5、膜分離提取法

膜分離技術也是一種常用的輔助提取技術，其中超濾法作為唯一能用於分子級別的分離方法廣泛的應用於黃酮類化合物的提取分離。利用超濾技術分離純化黃酮化合物最大的優點是操作簡便、無需加熱、不破壞活性成分的結構，純化和濃縮一步完成，超濾裝置還可反復使用。

(8)糖苷水相純化技術擴展閱讀

黃酮類化合物的顏色與分子中存在的交叉共軛體系及助色團（-OH）等的類型、數目及取代位置有關。一般來說，黃酮、黃酮醇及其苷類多呈灰黃至黃色，查爾酮為黃色至橙黃色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類等因不存在共軛體系或共軛很少，故不顯色。

花色素及其苷元的顏色，因pH的不同而變，一般呈紅（pH<7）、紫（7<8.5）、藍（PH>8.5）等顏色。

黃酮苷元一般難溶或不溶於水，易溶於甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑，易溶於稀鹼液。黃酮類化合物的羥基糖苷化後，水溶性相應加大，而在有機溶劑中的溶解度相應減少。黃酮苷一般易溶於水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶劑，難溶於乙醚、三氯甲烷、苯等有機溶劑。

黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶於鹼性水溶液、吡啶、甲醯胺及二甲基甲醯胺中。有些黃酮類化合物在紫外光（254nm或365nm）下呈不同顏色的熒光，氨蒸汽或碳酸鈉溶液處理後熒光更為明顯。多數黃酮類化合物可與鋁鹽、鎂鹽、鉛鹽或鋯鹽生成有色的絡合物