超純水PBS

⑴ 求助心肌細胞總蛋白提取方法

細胞總蛋白提取方法
一、溶液配製
1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml
稱取NaF 41.99mg，超純水8ml溶解後定容至10ml。 2. 100 mM PMSF 3. RIPA溶液 100ml
成分 分子量 終濃度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)
NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脫氧膽酸鈉

0.5 g
0.5%
溶解於80 ml超純水中，待溶解後加入HCl調pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入
成分 儲存濃度 加入量 終濃度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin
10μg/μl
0.2μl/1ml
2μg/μl
二、方法 1. 細胞收取
1) 細胞傳代至60mm培養皿中，待細胞融合約100%，收集細胞 2) 棄培養基，加入PBS 2ml清洗培養皿一次，棄PBS。 3) 加入0.05%胰酶2ml，37℃溫育1min。 4) 待細胞變形後，將細胞吹下轉移至一個1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃
5) 棄上清，1ml預冷的PBS清洗沉澱，10,000rpm×3min，4℃
6) 重復PBS清洗一次 7) 棄上清，-80℃凍存待裂解 2. 蛋白提取
1) 向細胞沉澱中加入200μl RIPA緩沖液(含1mM PMS、
1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混勻 後冰上放置40mins
10,000rpm×15min，4℃
將上清轉移至一個新的ependorf 管中（約250μl） 三、注意事項
1、低溫可避免蛋白降解，所有離心管需預冷。
2、PBS要吸干，但避免細胞幹掉，以免使蛋白濃度過低。 3、整個蛋白提取過程要快，這能保證干預的效果。

⑵ pbs有絮狀物能用嗎

pbs有絮狀物能用。

正常的，自己配的PBS高壓後是會有沉澱的，可以用0.22um的濾器過濾一下。

出現絮狀沉澱有很多種可能：

1、絮狀沉澱可能是磷酸鹽的晶體，解決的方法，將水先滅菌，然後再配。

2、可能出在氯化鈉上，換氯化鈉。

3、新配的PBS不穩定，要放置1天以後再高壓。

4、滅菌後，放在4度冰箱。

5、配母液的水為雙蒸水或超純水。

PBS緩沖液作用

PBS是磷酸緩沖鹽溶液的簡稱，一般的有活性的生物制劑都要用它來稀釋。

原因就是它具有鹽平衡、可調整的適宜pH緩沖作用，蒸餾水不具有鹽平衡作用，可以破壞生物蛋白的結構及生物特性；生理鹽水不具有調整pH的作用，對完整的、具有活性的物質不能保證其在最適條件下參與生物反應，所以使用PBS是首選。

PBS也不是萬能的，有的生物活性物質需要的條件比PBS還要高，就需要在平衡緩沖液中加入更多的成分，維持最佳的條件保證生物活性物質保持其最完整的特性。

⑶ 稀釋紅細胞裂解液用去離子水還是pbs

紅細胞裂解液的原理是利用細胞內外存在鹽離子濃度差異而導致細胞膜脹破，所以直接用水稀釋就行了。

⑷ 自來水與去離子水，PBS對組化有影響嗎

用自來水製作去離子水，要將水先通過石英砂過濾顆粒較粗的雜質，再通過陽離子交換樹脂（常用的為苯乙烯型強酸性陽離子交換樹脂），則水中的陽離子被樹脂所吸收，樹脂上的陽離子H 被置換到水中，並和水中的陽離子組成相應的無機酸；含此種無機酸的水再通過陰離子交換樹脂（常用的為苯乙烯型強鹼性陰離子）OH-被置換到水中，並和水中的H 結合成水。最後通過反滲透膜過濾，必要時再經過一步紫外殺菌以去除水中的微生物，即得到去離子水。
去離子水是指除去了呈離子形式雜質後的純水。國際標准化組織ISO/TC 147規定的「去離子」定義為：「去離子水完全或不完全地去除離子物質。」現在的工藝主要採用RO反滲透的方法製取。應用離子交換樹脂去除水中的陰離子和陽離子，但水中仍然存在可溶性的有機物，可以污染離子交換柱從而降低其功效，去離子水存放後也容易引起細菌的繁殖。

⑸ 用去離子水還是depc稀釋pbs

一般PBS緩沖溶液的PH值應該在6;L或者1mol/.1mol/，應該根據需要確定總濃度;L等.2之間，不在這個區域內市售depc 都是pbs溶液嗎 0.2-8

⑹ 配PBS滅菌之後發現有絮狀沉澱怎麼回事

出現來絮狀沉澱有很多種可能：自 1、絮狀沉澱可能是磷酸鹽的晶體，解決的方法，將水先滅菌，然後再配。 2、可能出在氯化鈉上，換氯化鈉。 3、新配的PBS不穩定，要放置1天以後再高壓。 4、滅菌後，放在4度冰箱。 5、配母液的水為雙蒸水或超純水。

⑺ 制備脂質體為什麼要用pbs不直接用去離子水

、脂質體離

適化結構親脂性葯物鑲嵌雙層膜內包裹脂質體其包封率取決於所用脂質濃度種情況包封率達90％定要除未包裹葯物水溶性葯物言包裹葯物僅總量部必須脂質體懸液除未包裹葯物由於脂質體比包裹葯物要利用同離除未包裹葯物些凝膠濾柱層析滲析等；若包裹物質蛋白質或DNA或者未包裹葯物能形較聚結物則利用與脂質體浮力、密度同採用諸離等進行離

()柱層析

凝膠滲透層析技術廣泛用於脂質體懸液離除未包裹葯物用於懸液脂質體組技術實驗室效且快速規模產雖用凝膠濾純化技術較困難且價格昂貴另外脂質體洗脫介質稀釋能需要增加濃縮步驟
柱層析填料用葡聚糖Sephadex G-50其步驟與規致必須指：①葡聚糖表面存著能與脂質體膜結合並相互作用微部位雖種作用並影響脂質體凝膠柱流特徵仍導致少量脂質損失使膜穩定性增加導致膜滲透性改變及包裹物質滲漏種現象脂質濃度較低情況特別應予注意般通加脂質體品柱量或用空脂質體預先柱飽解決通使用20mg脂質制單層脂質體飽10g凝膠；②若凝膠顆粒太細較脂質體能滯留凝膠柱層脂質體宜選用粗級凝膠(粒徑50～150μm)單層脂質體則用任何級別凝膠

(二)滲析

簡單用除未包裹葯物(化合物除外)需要復雜技術須昂貴儀器且能夠擴產通斷改換滲析介質除所游離葯物費般室溫條件要除95％游離葯物至少需要更換三滲析介質間10～24h外滲析介質滲透強度應與脂質體懸液致否則滲析改變脂質體懸液體積且能引起包裹物質滲漏

(三)離

同離力離離除同種類脂質體游離葯物效完全除游離葯物需重復懸浮離使脂質體沉所需離力取決於脂質體某種程度取決於混懸液絮凝狀態脂質體且布窄需要高速離及冰凍條件低速(2000～4000r／min)離能使脂質體沉降
顯於量脂質體利用高速冰凍離極其耗能昂貴適於離脂質體於比較脂質體低速離縮短操作間並且同較稀脂質體懸液濃縮所需濃度避免脂質體遭破壞必須注意保證重復混懸介質滲透壓與脂質體懸液滲透壓相致

二、脂質體包封率測定

()百包封率測定

顯考查包裹物質物體內行前必須測定該物質脂質體量採用述離除未包入脂質體游離物質利用式計算百包封率(Encapsulation percentageEN％)

EN％=(1Cf／Ct)×100％

式Cf游離葯物量；Ct脂質體懸液葯物總量
再介紹兩種快速、用量少且適應性廣離游離物質並測定EN％

1．微型柱離(minicolumn centrifugation method)

取塑料注射針筒填濾膜作襯片裝入用理鹽水溶脹Sephadex G-50再針筒置離管低速離(2000r／min3min)除余理鹽水凝膠柱變干並能與針筒內壁離精確定量加入脂質體品注意勿滴入柱床邊緣離(2000r／min3min)使脂質體進入離管待測再凝膠柱加入少量理鹽水依離離液能再脂質體或仍含少量主要取決於脂質體及組游離葯物程葡聚糖吸附離凝膠柱再加理鹽水離使柱干游離葯物洗脫進入離液反復幾直至全部游離葯物均柱離洗脫別測定包封葯物及游離葯物濃度計算EN％(圖20—10)

微型柱離優點脂質體懸液幾乎沒稀釋於實驗室規模試驗較用離除未包裹葯物快速測定包封率

2．魚精蛋白凝聚(protamine aggregation)

用於任何組脂質體性或帶負電荷脂質體(圖20－11)：

取0.1ml脂質體懸液於10ml錐形離管加入0.1ml魚精蛋白溶液(10mg／ml)攪勻靜置3min再加3ml理鹽水室溫條件離吸取2ml清液測定游離葯物濃度剩餘清液棄沉澱物0.6ml 10％ Triton X-100重新混懸使脂質體膜材溶解再補充理鹽水至總體積3.2ml測定包封葯物濃度便算EN％

(二)包裹容積測定

包裹容積(entrapped volume)指制脂質體相於每毫克磷脂所佔內水相體積般微升(μl)表示包裹容積計算通測定包裹脂質體內葯物總量推測假設脂質體內水性介質葯物濃度與始制備所用葯物濃度經離除未包裹葯物沒物質脂質體滲漏則容易計算許情況假設往往能立例用二乳化制備脂質體乾燥除機溶劑內水相能失；另外由於內外滲透壓差異水進入或逸脂質體測定內部容積辦直接測定水量例利用具光譜性液體代替內相介質利用核磁共振(NMR)測定測水量脂質體高速離(200000g6h)沉降緊密沉澱除盡清液沉澱物D20(deuterium oxide)重新混懸由於膜於水滲透性使整體系H20D20快達平衡取少量用於磷脂量測定剩餘部作水NMR掃描峰高與D20含水濃度比與標准溶液照即求水量計算脂質體包裹容積

三、脂質體穩定性

脂質體放置程能發種同變化磷脂質氧化水解短鏈磷脂並膜形具溶解性衍物；另外脂質體發凝聚、融合等物理變化導致包裹物質滲漏脂質體制劑若要發展產品應市必須貯藏期間具良穩定性；體內達靶組織前或發揮其緩釋作用前亦須保持定及完整性已證明脂質體血液比較穩定隨磷脂化性質、膽固醇比例脂質體、雙層數目等同脂質體體內穩定性所同若貯存程葯物脂質體迅速滲漏則必限制脂質體應用價值

()化穩定性

脂質體組磷脂氧化降解應制備即加防止採用些措施盡能降低氧化程度例使用新鮮提純磷脂新鮮蒸餾溶劑盡量避免高溫並充氮氧條件完制備程脂質體貯存於惰性環境等
膜材組加入抗氧劑種效目前用抗氧劑α-育酚種毒食用脂質據認蛋卵磷脂氧化解α-育酚加入減緩另選擇降低氧化程度使用飽磷脂代替飽磷脂源磷脂其飽度隨植物、蛋黃、哺乳物依增加於蛋黃磷脂飽度取決於物飼料及所用提純
論飽飽磷脂脂質體水性懸液都能水解形溶血磷脂脂肪酸溶血磷脂進步水解形甘油磷脂脂肪酸甘油磷酸間酯鍵難水解所產游離磷酸甘油精製豆磷脂脂質體水性懸液水解力已研究結表明豆磷脂水解主要受H+OH+催化作用pH6.5左右水解速率體系加入緩沖離醋酸、枸櫞酸緩血酸銨輕度增加豆磷脂水解

(二)物理穩定性

脂質體包裹葯物滲漏凝聚、融合團塊等物理穩定性問題脂質體研究工作難題些研究表明單層脂質體貯存體積增葯物滲漏與脂質及包裹葯物性質關由性磷脂制備脂質體凝聚主要由於范德華力相互作用所致膜材加入少量負電荷磷脂(10％PA或PG)克服膜材加入微量1,3-二乙醯-2-磷脂醯膽鹼阻止較脂質體融合
較脂質體制備適條件般發融合於40nm單層脂質體由於膜曲率易於發融合特別相變溫度更易發
採用前體脂質體等重建脂質體較避免脂質體貯存發化物理變化重建脂質體三種類型：含葯或含葯干脂質膜；含葯或含葯凍干脂質混合物：含葯凍干脂質體於干脂質膜或凍干脂質混合物重建所獲葯物包封率限特別親水性葯物包封率高懸液含較游離葯物實際應價值於具適結構親脂性葯物重建產品達較滿意包封率重建程所需條件例攪拌程度要求高溫超聲處理等實際應用甚便
於親水性葯物選擇含葯凍干脂質體重建形式報道冰凍程若加入親水性聚合物葡聚糖能產自由流能利於凍干脂質體水性介質重建例含胰島素凍干脂質體用種處理其重建包封率達原70％即冰凍重建程胰島素滲漏率約30％包裹低量葯物滲漏率能更高些種技術保證脂質體制劑貯存穩定性提供效

四、脂質體測定

脂質體影響脂質體體內處置脂質體重要質量指標測定脂質體激光掃描電顯微鏡或庫爾特粒度析疑電鏡測定準確直接觀察每脂質體並獲各范圍內脂質體外形精確信息要觀察量脂質體本非費相反．激光掃描非簡單且操作快速僅能測脂質體平均性質與類似採用庫爾特粒度析儀測脂質體布二種均難描述更精細結構關於粒度測定細節參見本書第十二章

五、脂質體析

()磷脂質析

1．含量測定

直接精確測定磷脂質濃度比較困難乾燥磷脂總含定量殘留溶劑或其雜質磷脂廣泛使用測定磷脂非直接例含磷量測定於制備脂質體數磷脂言每摩爾磷脂均含1mol磷僅別例外每摩爾磷脂含2mol磷品磷脂濃度通測定磷含量計算介紹二種磷測定

(1)Bartlett

磷脂機磷酸解機磷加入鉬酸銨使轉化磷鉬酸磷鉬酸用萘磺酸銨定量原藍色藍色強度由光光度測定與標准品(磷酸二氫鉀)照即計算含磷量該靈敏度較高且重現性若品含少量機磷則干擾測定

(2)Stewart

脂質體混懸於磷酸鹽緩沖液宜採用Stewart該利用磷脂機溶劑與亞鐵硫氰酸銨形色復合物受機磷存影響進行測定計算使用與磷脂結構關轉換吸收值換算磷脂毫克數該隨磷脂基同異利用磷脂標准液繪制標准曲線計算該適於測定含未知磷脂混合物特別須指該能用於甘油磷脂測定若脂質體含卵磷脂甘油磷脂則用該前者定量再通Bartlett測定總磷脂計算甘油磷脂量

2．磷脂質薄層層析

薄層層析檢查磷脂質純度主要手段與所層析磷脂質薄層層析利用磷脂液態機相親水性固定相同親性液相固定相展同磷脂具同保留間根據親水性強弱改變展劑組改變磷脂兩相配系數用固定相硅膠展劑則用含氯仿溶劑①氯仿：甲醇：水：(65：25：4 V／V)；②氯仿：甲醇：水：氨水(65：35：2.5：2.5 V／V)；③氯仿：丙酮：甲醇：醋酸：水(6：8：2：2：1 V／V)；④乙酸乙酯：環烷(1：1 V／V)等用顯色劑碘用50％硫酸 - 甲醇液或重鉻酸鉀液顯色

(三)磷脂氧化程度

1．磷脂氧化

磷脂脂肪酸氧化主要由於游離基作用電磁波輻射或者微量游離金屬離催化脂肪酸碳鏈首先脫氫原形游離基進與空氣氧發連鎖反應含雙鍵碳鏈更易受影響聚合飽磷脂特別容易氧化降解含單或飽脂肪酸脂質混合物磷脂氧化三階段進行：①單雙鍵偶合；②氧化物形；③形乙醛及鏈斷裂
值注意氧情況仍發游離基反應導致雙重或三重偶合形產氧化物另外降解步程要消耗偶合雙鍵終降解產物增加同笫步降解產物減少故難用種試驗評估磷脂氧化程度甚至即使應用幾同試驗仍僅能致估計氧化程相速率

2．氧化指數測定

氧化指數用檢測游離基偶合指標氧化偶合磷脂230nm左右具紫外吸收峰別於未氧化磷脂典型紫外吸收圖譜圖20－12

內提作制備脂質體膜材卵磷脂其氧化指數應控制0.2測定磷脂溶於水乙醇配定濃度澄明溶液別測定波233nm及215nm吸收值按式計算：
氧化指數 = A233nm／A215nm

3．氧化物測定

卵磷脂氧化產丙二醛及溶血磷脂等丙二醛(MDA)酸性條件與硫巴比妥酸(TBA)反應種紅色染料(TBA-Pigment)

該化合物波535nm處特異吸收吸收值即反映磷脂氧化程度丙二醛量與溶血間關系進行研究實驗證明每毫升含卵磷脂理鹽水丙二醛含量超2.3μg37℃放置1～2h即產溶血
除述估計磷脂氧化程度外根據聚合飽脂肪酸鏈氧化階段發斷裂或縮短用氣 - 液色譜解些醯基鏈變化

(四)膽固醇析

與磷脂質類似膽固醇純度及其氧化產物用氣 - 液色譜進行檢測另外由於膽固醇論游離型酯化型都能與含高氯酸鐵乙酸乙酯硫酸試劑反應鐵復合物波610nm處紫外吸收採用標准膽固醇溶液照計算膽固醇量

六、脂質體滅菌

許研究論文都認脂質體宜用加熱滅菌辦且各類輻射及各種化滅菌劑敏所能使用濾滅菌或採用菌操作進行制備影響脂質體廣泛應用於臨床重要原
近內採用100℃ 30min濕熱滅菌獲功滅菌前脂質體形態及均明顯變化滲漏率約5％另採用輻射滅菌即用60鈷發γ射線三磷酸腺苷脂質體甲氨蝶呤脂質體作輻射滅菌照射劑量15～20kGy菌試驗結均由試驗前陽性轉陰性脂質體粒徑滅菌前顯著變化滅菌所致滲漏率較
滅菌實用性能與混懸介質種類、磷脂組及純度等關採用121℃加熱20min滅菌處理幾種脂質體發現理鹽水脂質體發凝聚等滲糖溶液羥基化合物溶液發凝聚加熱滅菌具較高氧化物值含蛋卵磷脂散液稍變黃改用具低氧化物值蛋卵磷脂、氫化蛋卵磷脂或DPPC則變化性pH充入氮氣阻止顏色變化加入α-育酚效經0.4μm膜濾由蛋卵磷脂組脂質體變變化介質類型明顯影響加熱滅菌期間包裹羧基熒光素陰離負電荷脂質體(PC／chol／PG)發滲漏使用電荷脂質體(PC／chol／十八胺)僅加熱滅菌期間發滲漏且貯存間滲漏
感覺這樣的提問是沒有意義的
還是自己找下資料吧

⑻ 血清抗體干凍粉用何稀釋啊（是去離子水，PBS,還是生理鹽水啊 ）

你可以先加少量的水，比如100ul或者1ml的水溶解。溶解完後，稀釋可以用PBS或者專門的抗體稀釋液。

⑼ 配PBS滅菌之後發現有絮狀沉澱怎麼回事

出現絮狀沉澱有很多種可能：
1、絮狀沉澱可能是磷酸鹽的晶體，解決的方法，將水先滅專菌，然後再屬配。
2、可能出在氯化鈉上，換氯化鈉。
3、新配的PBS不穩定，要放置1天以後再高壓。
4、滅菌後，放在4度冰箱。
5、配母液的水為雙蒸水或超純水。

⑽ ELISA實驗的封閉劑（5%脫脂奶粉）為什麼要用PBS配製用去離子水配的話會有什麼影響

蛋白要在一定的鹽離子條件下才穩定,如果你直接用去離子水配封閉液,包被的蛋白可能會有影響.如果覺得用PBS麻煩,可以用生理鹽水.