離子交換色譜上樣量

1. 鍏ㄦ槸騫茶揣涓ㄧ誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨錛圛EC錛夊師鐞嗐佹搷浣滆佺偣鍙婂簲鐢

紱誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨錛圛EC錛夛紝榪欎釜寮哄ぇ鐨勫垎紱繪妧鏈錛屼互鍏剁嫭鐗圭殑鍘熺悊鍜屽箍娉涘簲鐢ㄥ惛寮曠潃縐戝﹀朵滑鐨勭洰鍏夈傚叾鏍稿績鍦ㄤ簬鍒╃敤紱誨瓙浜ゆ崲鍓傜殑紱誨瓙浜ゆ崲鐗規э紝閫氳繃紱誨瓙闂寸殑鐢佃嵎浣滅敤鍔涘樊寮傝繘琛岄珮鏁堝垎紱匯傜誨瓙浜ゆ崲鍓傜敱鍩鴻川銆佺數鑽峰熀鍥㈠拰鍙嶇誨瓙鏋勬垚錛屽垎涓洪槼紱誨瓙鍜岄槾紱誨瓙涓ょ嶇被鍨嬶紝姣忎釜縐嶇被鐨勯夋嫨鎬ч兘鐢卞鉤琛″父鏁癒鍜屼翰鍜屽姏鍙傛暟濡傜誨瓙鐢佃嵎銆佺數浠峰拰鍘熷瓙搴忔暟鍐沖畾銆

紱誨瓙浜ゆ崲榪囩▼鏄涓涓鍙閫嗙殑鍔ㄦ佽繃紼嬶紝鍏剁粨鍚堝姏鍙楀埌pK鍊煎拰絳夌數鐐圭殑褰卞搷銆傚湪錏嬬櫧璐ㄥ垎紱諱腑錛岀瓑鐢電偣鍘熺悊涓庣洂姊搴︽垨pH姊搴︾粨鍚堬紝浣垮緱媧楄劚鎴愪負鍏抽敭姝ラゃ傜誨瓙浜ゆ崲鏍戣剛鐨勫瓟鐘剁粨鏋勶紝鏃犺烘槸鐤忔按鎬ф爲鑴傦紙濡傚己閰-寮遍吀-寮辯⒈鏍戣剛錛夎繕鏄浜叉按鎬ф爲鑴傦紙濡傜氦緇寸礌鍜屼氦鑱旇憽鑱氱硸錛夛紝閮戒負紱誨瓙榪佺Щ鎻愪緵浜嗘湁鍒╂潯浠訛紝浣嗛夋嫨鏃墮渶閽堝規牱鍝佺壒鎬ф潵鍐沖畾銆

鍦ㄥ疄闄呮搷浣滀腑錛岀誨瓙浜ゆ崲鍓傜殑閫夋嫨鑷沖叧閲嶈侊紝濡傞槼紱誨瓙浜ゆ崲鍓傞拡瀵規ｇ數鑽風墿璐錛岄槾紱誨瓙浜ゆ崲鍓傞拡瀵硅礋鐢佃嵎錛屾垨鑰呴拡瀵逛袱鎬х誨瓙鐨勭壒瀹歱H鑼冨洿銆傚己鍨嬩氦鎹㈠墏閫傜敤浜庡箍娉涚殑pH鑼冨洿錛岃屽急鍨嬪垯鍦ㄤ腑鎬pH鏉′歡涓嬩繚鎸侀珮浜ゆ崲瀹歸噺銆傚己閰告爲鑴傚逛簬紕辨ц泲鐧借川灝ゅ叾鏈夋晥錛屽弽紱誨瓙鐨勯夋嫨鍒欏彇鍐充簬緇撳悎鍔涳紝寮洪吀鍨嬮夋嫨H鍨嬶紝寮遍吀鍨嬮夋嫨Na鍨嬨

棰勫勭悊鍜屽啀鐢熻漿鍨嬫槸緇存寔鏍戣剛鎬ц兘鐨勫叧閿鐜鑺傦紝鍙鑳藉寘鎷鏍戣剛嫻告場銆侀櫎鏉傝川錛堥吀紕卞勭悊錛変互鍙婂啀鐢熸ラゃ備翰姘存ф爲鑴傚彲鑳介渶瑕佷嬌鐢∟aOH/NaCl鎴朒Cl澶勭悊錛岃岀惣鑴傜硸鍒欏彲閫氳繃閰哥⒈嫻告場澶勭悊銆傝呮熅鏃訛紝鏌遍珮涓庣洿寰勭殑姣斾緥銆佺誨瓙寮哄害閮戒細褰卞搷鍒嗙繪晥鏋滐紝瑁呮熅闇鍧囧寑鍒嗗竷錛岄伩鍏嶆皵娉′駭鐢熴傛牱鍝佷笂鏌辨椂錛屽鉤琛＄紦鍐叉恫鏄鍩虹錛岄殢鍚庡潎鍖鍔犲叆錛屾礂鑴卞垯闇瑕佺簿緇嗚捐★紝閫氳繃鍒嗘點佹搴︽垨澶嶅悎鏂規硶鎻愰珮鍒嗚鯨鐜囥

璐ㄥ勭悊鏃訛紝浜叉按鎬ф爲鑴傞噰鐢ㄤ箼閱囨垨涓欓叜錛岄吀紕卞勭悊鐢ㄤ簬鐞艱剛緋栥傛敹闆嗘礂鑴辨恫鏃訛紝搴旀帶鍒舵祦閫燂紝鍒嗘ユ敹闆嗕互紜淇濆崟涓鐗╄川鐨勭函搴︺傜『瀹氭礂鑴辨恫嫻侀熸椂錛岄氬父鍦5~8cm³/(cm²-h)鑼冨洿鍐呭疄楠岋紝鏀墮泦1%~2%鏌變綋縐鐨勬礂鑴辨恫錛岄氳繃鐩戞祴鍚稿厜搴︾粯鍒舵礂鑴辨洸綰褲傜誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨鍦ㄨ泲鐧借川綰鍖栵紙濡傜豢璞嗗嚑涓佽川閰訛級鍜岀瓑鐢電偣嫻嬪畾錛堝傞キ璞囪眴鍑濋泦緔狅級絳夐嗗煙琛ㄧ幇鍑鴻壊錛屽嚟鍊熷叾楂樼伒鏁忓害鍜岄噸澶嶆э紝鎴愪負縐戝﹀朵滑鐨勫緱鍔涘伐鍏楓

鎬葷殑鏉ヨ達紝紱誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨閫氳繃綺懼瘑鐨勬搷鎺у拰絳栫暐鎬у簲鐢錛屼負縐戝﹀朵滑鎻愪緵浜嗕竴縐嶅己澶х殑宸ュ叿錛岀敤浜庣簿緇嗗垎紱誨拰鍒嗘瀽澶嶆潅鐨勭敓鐗╁垎瀛愶紝鏄鐜頒唬鐢熺墿鍖栧﹀拰鍒嗗瓙鐢熺墿瀛﹀疄楠屽や腑鐨勫繀澶囨妧鏈銆

2. 大孔樹脂吸附技術和凝膠過濾色譜的區別

凝膠過濾色譜法：解析度較高，但是上樣量僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴版格的限制。離子交換色譜權法：根據目的蛋白質表面所含有的氨基酸殘基帶有的凈電荷分離蛋白質，但是解析度沒有凝膠過濾高。親和層析法：根據生物分子的特異性分離目的蛋白，特異性很高，但是配件容易丟失適合含有特異性的標簽的或者抗體。疏水色譜：根據疏水性來分離蛋白質,缺點是有的蛋白質在高鹽中溶解度降低，所以應用范圍受到限制，適合蛋白質表面含有較多疏水性氨基酸殘基的疏水性蛋白質。

3. 離子交換纖維素色譜法離子交換的分類及常見種類

離子交換纖維素色譜法主要依據離子交換劑的類型和特性進行分類，包括陽離子交換劑和陰離子交換劑，這兩類又可以根據解離性強弱進一步細分為強酸性和弱酸性、強鹼性和弱鹼性。

1. 陽離子交換劑，如磺酸、磷酸、羧酸和酚羥基等酸性基團的交換劑，如國產的1×7樹脂和國際品牌的Dowex 50、Zerolit 225，它們屬於強酸型。反應方式包括強酸性R-SO3-H++Na+ R-SO3- Na+H+和弱酸性R-COOH+Na+ R-COONa+H+。

2. 陰離子交換劑，如伯胺、仲胺、叔胺和季胺等鹼性基團的交換劑，如國產的#201號樹脂和Dowex 1、Dowex 2、ZerolitFF，它們屬於強鹼型。反應方式有強鹼性R-N+（CH3）2 H·OH-+Cl R-N+（CH3）2 Cl+OH-和弱鹼性R-N+（CH3）2 H·OH-+Cl R-N+（CH3）2 HCl+OH-。

離子交換劑種類豐富，例如纖維素離子交換劑有CM-纖維素（陽離子）和氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素，陰離子）。交聯葡聚糖離子交換劑如Sephadex，有陰離子和陽離子兩種，如DEAE-Sephadex A-25、A-50和CM-Sephadex C-50等，英文字頭A代表陰離子，C代表陽離子，數字表示型號。瓊脂糖離子交換劑如DEAE-Sephades和CM-Sepharose，是通過DESE-或CM-基團附著在Sepharose CL-6B上製成，具有優良的分離性能和穩定性。

Sober和Peterson於1956年首次將離子交換基團結合到纖維素上，製成了離子交換纖維素，成功地應用於蛋白質的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發展。離子交換基團不但可結合到纖維上，還可結合到交聯葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。近年來離子交換色譜技術已經廣泛應用於蛋白質、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。

4. 全是干貨丨離子交換色譜（IEC）原理、操作要點及應用

離子色譜分為三種類型：離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對色譜，本文將深入分析離子交換色譜的基本原理、操作要點及應用。

離子交換色譜（IEC）是基於離子交換劑與周圍介質中帶電離子間的電荷作用力不同，實現分離的一種柱層析法。IEC所用色譜填料——離子交換劑，通常為人工合成的多聚物，包括基質、電荷基團和反離子三部分。基質多採用瓊脂糖或葡聚糖凝膠，通過酯化、醚化或氧化等化學反應引入電荷基團，能與帶相反電荷的化學物質進行交換吸附。離子交換劑在水中呈不溶解狀態，能釋放反離子，與溶液中的其他離子或離子化合物結合吸附。結合後，離子交換劑及被結合物的理化性質不改變。

IEC根據離子交換劑上可電離基團的不同，分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。反離子帶正電的（如Na+、H+）為陽離子交換劑，反離子帶負電的（如Cl-）為陰離子交換劑。溶液中的離子通過離子交換柱時，競爭性結合離子交換劑上的荷電部位，移動速率取決於親和力、電離程度及溶液中競爭性離子性質和濃度。

離子交換反應是可逆的。以RA代表陽離子交換劑，溶液中的陽離子A*與溶液中的陽離子B+可發生可逆交換反應，平衡遵循質量作用定律。離子交換劑對不同離子的結合力由其選擇性決定，選擇性可通過平衡常數K表示。K值反映離子交換劑對不同離子的結合力或選擇性參數。

離子交換劑對有機鹼的選擇性隨pK增大而增大，對兩性化合物的選擇性隨等電點增大而增大。反之，對有機酸的選擇性隨pk減小而增大，兩性化合物隨等電點減小而增大。

溶液中離子與交換劑離子交換，電性越強越易交換。陽離子樹脂在稀溶液中，交換量隨電價增大而增大。強鹼性樹脂對負電性基團的結合力次序為CH3COO-，弱鹼性陰離子交換樹脂結合力次序為F-。蛋白質等電點是離子交換層析進行的重要依據，pH在等電點時分子無電荷，與交換劑間無靜電作用。高於等電點時，分子帶負電，結合陰離子交換劑；低於等電點時，帶正電，結合陽離子交換劑。蛋白質與交換劑結合是可逆的，鹽梯度或pH梯度可將吸附蛋白質從柱上洗脫。

離子交換劑應高度不溶，物理化學性質穩定，具有較多交換基團和大表面積或疏鬆孔狀結構。離子交換劑分為疏水性和親水性兩大類。疏水性離子交換劑具有大交換容量、快流速和高機械強度，適用於小分子物質分離和蛋白質、核酸等純化。親水性離子交換劑適用於大分子多價電解質分離，具有良好的解析度。

離子交換劑的選擇需根據樣品物質的理化性質。陰離子或陽離子交換劑的選擇取決於被分離物質的電荷性質。兩性電解質蛋白質的分離需根據pH決定。離子交換劑的基質影響分離效果，親水性基質適用於生命大分子物質分離。交聯度影響分離性能，小分子物質選擇交聯度大的介質。交換容量和交換速度是重要考慮因素。

緩沖液的選擇需考慮pH、離子強度和對目標蛋白活性的影響。兩性蛋白質的分離需調整緩沖液pH。常用防腐劑包括疊氮鈉和乙基汞硫代水楊酸。

離子交換色譜的基本操作包括交換劑預處理、再生、轉型、裝柱、樣品上柱、洗脫和收集。裝柱時需均勻分布交換劑，避免氣泡產生。洗脫是關鍵步驟，可通過改變離子強度或pH實現。

IEC廣泛應用於蛋白質、多肽、氨基酸和有機酸等生化物質的分析分離，以及樣品脫色。分離純化蛋白質是IEC的主要應用之一。例如，通過凝膠親和層析、離子交換層析和凝膠色譜等步驟，可有效分離純化綠豆幾丁質酶。蛋白質等電點的測定是IEC的另一重要應用，通過交換劑與蛋白質間的結合力隨pH改變的特性實現。

5. 離子交換色譜法的介紹

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰專離子的一屬種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法進行分離。現在它不僅適用於無機離子混合物的分離，亦可用於有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。

6. 關於液相色譜法純化蛋白質

凝膠過濾色譜法：來 解析度較高源，但是上樣量僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴格的限制
離子交換色譜法：根據目的蛋白質表面所含有的氨基酸殘基帶有的凈電荷分離蛋白質，但是解析度沒有凝膠過濾高
親和層析法： 根據生物分子的特異性分離目的蛋白，特異性很高，但是配件容易丟失 適合含有特異性的標簽的或者抗體
疏水色譜：根據疏水性來分離蛋白質，缺點是有的蛋白質在高鹽中溶解度降低，所以應用范圍受到限制，適合蛋白質表面含有較多疏水性氨基酸殘基的疏水性蛋白質

7. 簡述離子交換色譜法

離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)
離子色譜分析法出現在20世紀70年代，80年代迅速發展起來，以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象。
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。
表達式
離子交換色譜的分配系數又叫做選擇系數，其表達式為：

K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}

其中[RX + ]表示與離子交換樹脂活性中心結合的離子濃度，[X + ]表示游離於流動相中的離子濃度

分離原理
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

陽離子交換:

陰離子交換:

式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團。

離子交換反應的平衡常數分別為：

陽離子交換：

陰離子交換：

平衡常數K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由於不同的物質在溶劑中離解後，對離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數。親合力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。

固定相
離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式，一是常見的純離子交換樹脂。第二種是玻璃珠等硬芯子表面塗一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂，第三種為大孔徑網路型樹脂。它們各有特點，例如第二種樹脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三種樹脂適用於非水溶液中物質的分離，因為它們的孔徑和內表面積大，不需要用水溶脹，便可滿意地使用。

典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交聯共聚而成：

其中，二乙烯基苯起了交聯和加牢整個構型的作用，其含量決定了樹脂交聯度大小。交聯度一般控制在4％～16％范圍內，高度交聯的樹脂較硬而且脆，也較滲透，但選擇性較好。在基體網狀結構上引入各種不同酸鹼基團作為可交換的離於基團。

按結合的基團不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂上具有與樣品中陽離子交換的基團。陽離子交換樹脂又可分為強酸性和弱酸性樹脂。強酸性陽離子交換樹脂所帶的基團為磷酸基（一），其中和有機聚合物牢固結合形成固定部分，是可流動的能為其他陽離子所交換的離子。

陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團。陰離子交換樹脂也可分為強鹼性和弱鹼性樹脂。

陰離子交換樹脂屬強鹼性，它是由有機聚合物骨架和一季胺鹼基團所組成，它帶有正電荷。而與相反的是可以移動的部分，它能被其它陰離子所交換

流動相
離子交換色譜的流動相最常使用水緩沖溶液，有時也使用有機溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，並改善樣品的溶解度。

離子交換色譜所用的緩沖液，通常用下列化合物配製：鈉、鉀、被的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應的酸混合成酸性緩沖液或氫氧化鈉混合成鹼性緩沖液等。