A. DEAE－32與DEAE－52有何區別
兩者均為弱陰離子交換類型，DE52為預溶漲細顆粒DEAE-纖維素。DE32（乾燥細顆粒DEAE-纖維素）功能如同DE52，但需預處理。
B. DEAE-52纖維素柱求助
DEAE-纖維素復 DEAE cellulose DEAE-纖維素 DEAE cellulose 為二乙氨乙基纖制維素。是陰離子交換纖維素之一。 DEAE—纖維素的活化：稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹後DEAE的體積。根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE
C. 多糖分離純化—離子交換層析和柱層析
多糖，與蛋白質一樣，對生命過程起著關鍵作用，其復雜結構直接決定了其特性和功能。要深入理解多糖，分離純化步驟至關重要。其中，離子交換層析和凝膠層析是常用的手段。
離子交換層析在多糖純化中應用廣泛，其根據多糖特性，選擇合適的陽離子、陰離子或硼砂交換劑，如DEAE cellulose、DEAE Sephadex（葡聚糖）、DEAE Sepharose（瓊脂糖）系列。以DEAE cellulose-52為例，它作為陰離子交換柱，其填料二乙氨乙基纖維素帶有正電荷，能有效分離中性和酸性多糖，如果膠，通過鹽溶液洗脫，中性糖先被洗脫，陰離子多糖隨後。通過檢測洗脫液糖含量，形成洗脫曲線，實現不同多糖的分離。
相比之下，凝膠層析則側重於分子量的分離。其原理是利用分子篩特性，大分子先流出，小分子後流出，如Sephadex G系列填料，如G-15、G-25用於寡糖分離，G-100和G-200則適用於大分子多糖。通過觀察洗脫曲線，可以精確收集不同分子量的樣品。
D. SephadexG-200柱層析是什麼
SephadexG-200
Sephadex是葡聚糖凝膠過濾層析技術。利用具有多孔網狀結構的凝膠顆粒的分子篩作用，根據分離樣品中分子量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。每一種特定的凝膠介質都有特定的分子量分級范圍。根據其分級范圍，可以將溶質分子分為三類：全排阻分子、全滲透分子以及部分滲透分子。按照分子在層析凝膠中的保留時間長短逐步洗脫。SephadexG加一個數字，數字越小的介質交聯度越大，分級范圍越小，而數字越大的介質交聯度越小，分級范圍越大。G-200分離分子量范圍500-800 000
DEAE-纖維素52
就是陰離子交換層析，是按照離子強度對蛋白質進行分離， 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。
⒈ 離子交換劑預處理和裝柱 對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為H+型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉ 加樣與洗脫 加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊ 洗脫餾份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋ 離子交換劑的再生與保存 離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/: NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌ 離子交換層析的應用 離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
SephadexG-200食葡聚糖凝膠層析，G後面加一個數字，數字越小的介質交聯度越大，分級范圍越小，而數字越大的介質交聯度越小，分級范圍越大。這些是蛋白質分離技術提純的基本技術，就是分子篩，適合大量蛋白的提純，G-200一般就是分離分子量差距較大的混合物質。
替代方法可能會有超濾，也是截流分子量。HPLC高效液相色譜等分離方法，但是還是離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。
⒈ 離子交換劑預處理和裝柱 對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為H+型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉ 加樣與洗脫 加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊ 洗脫餾份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋ 離子交換劑的再生與保存 離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/: NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌ 離子交換層析的應用 離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
替代方法也許超濾可以，但只能以此截流固定分子量。高效液相色譜，這個十分方便，但是儀器很貴，如果SephadexG-200等方法可以進行分離，還是比高效液相便宜的......
E. DEAE-纖維素使用方法
DEAE—纖維素的活化過程如下：首先，取適量的IgDEAE32或52，比如1克，放入5毫升的量筒中，加入蒸餾水並浸泡過夜。待DEAE完全溶脹後，觀察其體積。根據需要的層析柱柱床體積，計算所需的DEAE用量，然後同樣用蒸餾水浸泡過夜，期間需更換幾次水，以去除細小顆粒。使用布氏漏斗抽干後，用0.5毫升/升的NaOH溶液浸泡至少1小時，再抽干。接著，用無離子水漂洗，直至pH值達到約8（通過pH試紙檢查）。然後，再用0.5毫升/升的HCl溶液浸泡1小時，去除酸性物質，用無離子水清洗至pH值約為6。在本實驗中，DEAE—纖維素應在使用前用0.0175摩爾/升的pH6.7磷酸鹽緩沖液浸泡，以達到平衡狀態。
DEAE—纖維素的再生是一個循環過程，雖然並非每次都需用酸和鹼進行反復處理。通常，只需進行「轉型」處理即可。比如，如果希望陽離子交換劑帶有NH+4，可以使用NH4OH溶液浸泡；若要陰離子交換劑帶上Cl—，則使用NaCl溶液處理。在本實驗中，DEAE—纖維素在經過酸鹼處理後，只需用0.0175摩爾/升的pH6.7磷酸鹽緩沖液浸泡，以HPO4替換DEAE中的OH—，即可完成轉型。在再生過程中，由於DEAE—纖維素常會吸附大量雜蛋白，因此，再生時應首先用0.5毫升/升的NaOH溶液浸洗，沖洗至pH約8，然後進行轉型，即可再次使用。
F. deae-陰離子纖維素的使用方法
DEAE－纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實驗採用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑乾粉浸泡於蒸餾水中，去除雜質；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，並將其在抽濾漏斗中抽干；將抽乾的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恆流泵，下出口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恆流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001M EDTA)，預先將DE-52柱進行平衡。
G. 免疫球蛋白提取實驗注意事項及原因
IgG的分離與提純
（一）材料與試劑配製
1．動物血清
2．硫酸銨飽和溶液
硫酸銨 800g~850g
H2O 1 000ml
加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然後以28％NH4OH調pH至7.0（不調pH值也可以）。
註：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過夜後濾過，加熱蒸發H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化後過濾，然後再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃紙）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合後，靜置30min。
2．3 000r/min離心20min，棄去沉澱，以除去纖維蛋白。
3．在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
4．3 000r/min離心20min，棄上清。
5．於沉澱中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合後，靜置30min。
6． 3 000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。
7． 用10ml生理鹽水溶解沉澱，裝入透析袋。
8． 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中於4℃透析24h，中間換液數次。
以1％BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4+（取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現磚紅色即認為有NH4+存在），直至無 SO42-或NH4+出現為止。也可採用SephadexG25或電透析除鹽。
9． 離心去沉澱（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉澱血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．過DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。
也可採用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白質及其定量鑒定（見本章第八節）。
12．IgG的純度鑒定 可採用下列方法之一鑒定。
⑴ 區帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳後，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
⑵ 瓊脂雙相雙擴散鑒定：預先准備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉澱線。
⑶ 免疫電泳鑒定：（操作見第三章免疫電泳部分）。孔內加待測樣品，電泳後，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉澱線，且沉澱線位於γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
⑷ 圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。
13．IgG的濃縮與保存
⑴ IgG的濃縮：參看本章第九節。
⑵ IgG的保存：一般濃縮至1％以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。
（三）IgG的簡易快速提取法
應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往採取下列的簡易辦法。
1． DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。
⑴ 以一定數量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。
⑵用布氏漏斗（內放兩層濾紙）過濾。
⑶以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。
⑷於4℃中放置1h，中間攪拌數次。
⑸用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50為弱鹼性陰離子交換劑，經NaOH將Cl-型轉變為OH-型後，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G屬中性蛋白外其餘均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ－G。這種提取法流程大大縮短，純化前後樣品體積變化不大，而且所得γ－G無變性現象。經過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE－SephadexA－50若干克，懸浮於蒸餾水中，1h後傾去上層小顆粒，然後用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，最後以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾乾的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。
⑶ 再用同樣重量的DEAE－SephadexA－50處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ－G製品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）後，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。