離子交換層析柱拖尾

① 請問 氣相色譜質譜 液相色譜質譜 還有離子色譜 幾者之間的區別

色譜法,又稱色層法或層析法，是一種物理化學分析方法，它利用不同溶質（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質達到相互分離。它的英文名稱為：chromatography這個詞來源於希臘字 chroma和 graphein，直譯成英文時為 color和writing兩個字;直譯成中文為色譜法。但也有人意譯為色層法或層析法。

在色譜法中，靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相（stationary phase） ；運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相（mobile phase）。

流動相是氣體的稱為氣相色譜，流動相是液體的稱為液相色譜。

離子色譜：
狹義定義：
以低交換容量的離子交換樹脂為固定相對離子性物質進行分離，用電導檢測器連續檢測流出物電導變化的一種液相色譜方法。
廣義定義：
利用被測物質的離子性進行分離和檢測的液相色譜法。
所以離子色譜實際上是液相色譜的一種。

質譜分析法是通過對被測樣品離子的質荷比的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然後利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質荷比（m/z）分開而得到質譜，通過樣品的質譜和相關信息，可以得到樣品的定性定量結果。

簡單來說色譜是是物質的分離方法，質譜是檢測方法。

一般的色譜用電導檢測器或UV檢測，牛B的用質譜檢測。

② HPLC原理是什麼

原理：

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別。

被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據就可以以圖譜形式列印出來，以便研究人員分析。

(2)離子交換層析柱拖尾擴展閱讀：

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。

高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

HPLC使用的色譜柱是很細的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（幾μm到幾十μm)，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。

為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：

a. 流量恆定，無脈動，並有較大的調節范圍（一般為1~10 mL/min)；

b. 能抗溶劑腐蝕；

c. 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×10^5Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150~300×10^5Pa。

⑴往復式柱塞泵

當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。

反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響，連續供給恆定體積的流動相。

⑵氣動放大泵

其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（ SA ）活塞A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數取決於 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恆壓泵。

③ 層析是什麼意思

層析是「色層分復析」的簡稱。制利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用於有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。
層析（chromatography）利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
酸鹼性的區別就是，在層析過程中它們吸附的離子或者說帶點體的正負不一樣

④ 什麼是梯度洗脫

梯度性地改變洗脫液的組分(成分、離子強度等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來的方法。

梯度洗脫（gradient elution）又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。

在氣相色譜中，為了改善對寬沸程樣品的分離和縮短分析周期，廣泛採用程序升溫的方法。而在液相色譜中則採用梯度洗脫的方法。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復雜樣品中的性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。 梯度洗脫的優點：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加靈敏度。但有時引起基線漂移。

分級梯度洗脫
分級梯度洗脫是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合於電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用，稱為陰離子交換劑。

⑤ HPLC的常用術語解釋

高效液相色譜法(HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。它是在生化和分析化學中常用的柱層析儀。接下來我為大家整理了HPLC的常用術語解釋，希望對你有幫助哦!

第一部分色譜曲線

1、色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測器系統時所產生的響應信號對時間或流動相流出體積的曲線圖，或者通過適當的 方法 觀察到的紙色譜或薄層色譜斑點、譜帶的分布圖。

2、(色譜)峰(chromatographic peak)：色譜柱流出

3、峰底(peak base)：峰的起點與終點之間的連接的直線

4、峰高(h ，peak height)：色譜峰最大值點到峰底的距離(圖1 中的BE)。

5、峰寬(W ，peak width)：在峰兩側拐點(圖1 中的F ，G)處所作切線與峰底相交兩點的距離

6、半高峰寬(W h/2 ，peak withd at half height)：通過峰高的中點作平行於峰底的直線，此直線與峰兩側相交兩點之間的距離(圖1 中的HJ)。

7、峰面積(A ，peak area)：峰與峰底之間的面積

8、拖尾峰(tailing peak)：後沿較前沿平緩的不對稱的峰。

9、前伸峰(leading peak)：前沿較後沿平緩的不對稱的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

10、假峰(ghost peak)：除組分正常產生的色譜峰外，由於儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現的色譜峰，即並非由試樣所產生的峰。這種色譜峰並不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。(又叫鬼峰)

11、畸峰(distrorted peak)：形狀不對稱的色譜峰， 前伸峰、拖尾峰都屬於這類。

12、反峰(negative peak)：也稱倒峰、負峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。

13、原點(origin)：紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點

14、斑點(spot)：平面色譜法中，組分在展開和顯譜後呈現近似圓形或橢圓形的色區

15、區帶(zone)：在色譜柱、紙或薄層板上被分離組分所佔的區域。

16、復斑(multiple spot)：一種組分展開後形成兩個或多個清晰斑點。

17、區帶拖尾(zone tailing)：由於物理、化學等作用的影響，一種組分在展開後形成的彗星形狀斑點。

18、基線(base line)：在正常操作條件下，僅有流動相通過檢測器系統時所產生的響應信號曲線。

19、基線漂移(baseline drift)：基線隨時間定向的緩慢變化。

20、基線雜訊(N，baseline noise)：由於各種原因而引起的基線波動。

21、統計矩(moment)：色譜流出曲線是組分在檢測器中濃度或質量依時間的統計分布曲線，響應值對應於分布密度。組分在柱內遷移時間r次冪的數學期望稱為流出曲線的r階原點矩。而組分在柱內遷移時間與平均遷移時間差的r次冪的數學期望稱為流出曲線的r階中點矩。

22、一階原點矩(first origin moment)：組分在柱內遷移時間的數學期望。當流出曲線為對稱峰時，即為組分的保留時間。

23、二階中心矩( μ2 ，second central moment)：二階中心矩為流出曲線的方差。定義為：μ2=E(t-Et)2 式中，E代表平均。

24、三階中心矩(μ3 ，third central moment)：定義為：μ3=E(t-Et)3

可以表示流出曲線的不對稱程度。峰形對稱時μ3=0，前伸峰μ3<0，拖尾峰μ3>0.

第二部分分離模式

1、液相色譜法(liquid chromatography ，LC)：用液體作流動相的色譜法。

2、液液色譜法(liquid liquid chromatography，LLC )：將固定液塗漬在載體上作為固定相的液相色譜法。

3、液固色譜法(liquid solid chromatography，LSC )：用固體(一般指吸附劑)作為流動相的液相色譜法。

4、正相液相色譜法(normal phase liquid chromatography ，NPLC)：固定相的極性較流動相的極性強的液相色譜法。

5、反相液相色譜法(reversed phase liquid chromatography，RPLC )：固定相的極性較流動相的極性弱的液相色譜法。

6、柱液相色譜法(liquid column chromatography )：在柱管內進行組分分離的液相色譜法。

7、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC )：具有高分離效能的柱液相色譜法。

8、尺寸排除色譜法(size exclusion chromatography，SEC )：用化學惰性的多孔性物質作為固定相，試樣組分按分子體積(嚴格來講是流體力學體積)進行分離的液相色譜法。

9、凝膠過濾色譜法：(gel filtration chromatography )：水或水溶液作為流動相的體積排除色譜法。

10、凝膠滲透色譜法：(gel permeation chromatography ，GPC)：有機溶劑作為流動相的體積排除色譜法。

11、親和色譜法(affinity chromatography )：用連接在基體上的配位體做固定相，使其與蛋白質或其他大分子發生可逆的高選擇性的相互作用，利用不同親和力進行分離的液相色譜法。

12、離子交換色譜法(ion exchange chromatography ，IEC)：以離子交換作用分離離子型化合物的液相色譜法。

13、離子色譜法(ion chromatography )：以含有某種特定離子的水溶液作為流動相，流出液通過抑制柱(或不通過抑制柱)，在降低流動相背景信號的條件下用於分離離子的液相色譜法。

14、離子抑制色譜法(ion suppression chromatography )：通過調節流動相的PH值來抑制試樣組分的電離，以分離離子型化合物的液相色譜法。

15、離子對色譜法(ion pair chromatography )：用形成離子對化合物進行分離的液相色譜法。16、疏水作用色譜法(hydrophobic interation chromatography )：用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動相，借疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

17、制備液相色譜法(preparative liquid chromatography)：用能處理較大量試樣的色譜系統，進行分離、切割和收集組分，以提純化合物的液相色譜法。

18、平面色譜法(planar chronatography)：在平面介質上進行組分分離的色譜法，也叫平板色譜法。

第三部分 常用術語

M：分子量

MC：二氯甲烷(methylene chloride)

MeOH：甲醇(methanol)

MS：質譜

h：峰高

HPLC：高效液相色譜

ID：內徑，dC

A：吸收度(式3.1，3.2);也作面積

ACN：乙腈(acetonitrile)

B(%B)：二元流動相中的強溶劑(% v/v)

C8，C18：烷基鍵合相的鍵長度(八烷基或十八烷基)

CD：環糊精(cyclodextrin)

CV：變異系數(通常以%表示);式15.3

dC：色譜柱內徑(cm)

dP：顆粒直徑(μm)

DAD：二極體陣列檢測器

EC：電化學(檢測器)

F：流速(ml/min)

FL：熒光(檢測器)

GS：梯度斜度參數(式8.2a);k*=20/GS

IEC：離子交換色譜(ion-exchange chromatography)

IPC：離子對色譜 (ion-paire chromatography)

k：保留因子(式2.4)

k*：梯度洗脫中，k的有效值或平均值(式8.1)

ka，kZ：色譜圖中，首峰(a)和末峰(z)的k值

L：色譜柱長度(cm)

LC-MS：液相色譜-質譜

MTBE：甲基-叔-丁醚(methyl-t-butyl ether)

N：色譜柱塔板數(式2.82.8b)

N：噪音(式3.3，圖3.3)

NARP：非水反相HPLC

NPC：正相色譜

P：色譜柱壓力降(通常以psi表示)(式2.9)

pKa：酸或供質子鹼的酸性常數

PAH：多環芳烴(polyaromatic hydrocarbon)

RS：分離度(式2.1)

RI：折光指數

RPC：反相色譜

S：信號;式3.3;圖3.3;以及由式6.1定義的參數

tD：延遲或滯留時間(min，用於梯度洗脫中);等於VD/F

tG：梯度時間(min)

tR：保留時間(min)(圖2.2);等於tO(1+k)

tRa，tRz：色譜圖中首峰(a)與末峰(z)的保留時間，tR(min)(圖8.6a)

tO：色譜柱死時間(min)(式2.5)

t1，t2：相鄰譜峰1與譜峰2的保留時間(min)

TEA：三乙胺(triethylamine)

THF：四氫呋喃(tetrahydrofuran)

UV：紫外光譜

VD：延遲或滯留體積(mL);為梯度混合器與色譜柱人口之間的體積(包括混合器的體積)

Vm：色譜柱死體積(mL)(式2.6);Vm為色譜柱內部的流動相體積，不包括附於固定相上的溶劑

Vmax：最大樣品體積(mL)(式13.1)

Va：樣品體積(mL)

w：重量(mg);也作半峰高處的峰寬(min)

wmax：不超載色譜柱的最大進樣量(mg)(式2.17)

wS：色譜柱的飽和容量(mg)(式13.4)

W：峰底寬(min)(圖2.2)

Wth：大進樣量對峰底寬的貢獻(min)(式13.2)

WO：小進樣量的峰底寬(min)

W1/2：半峰高處的峰寬(min)(圖1.1)

a：分離因子，等於k2/k1，其中k2與k1分別為相鄰譜峰2和譜峰1的k值

△tR：tRz-tR(min)

△%B：梯度洗脫期間，%B的變化

ε：摩爾吸收系數

εo：正相HPLC 中溶劑或溶劑混合液的強度

η：粘度(CP)

<<不常有符號>>

A，B，C：式2.11中的常數;數值A，B與C隨k值而變化，但改變 其它 條件或溶質時基本不變

A，B，C：式2.10中的常數;數值A，B與C隨條件和樣品而變化

A，B，C：式2.10a中的常數;數值A，B與C隨條件和樣品而變化

C：譜峰最大值處的濃度(mol/L)

CO：注入樣品中溶質的濃度(mol/L)

GI：化學電離(MS)

DGA：N，N-二甲基-1-萘醯胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)

EI：電子電離(MS)

ELS：蒸發光散 射擊 (Evaporative light scattering)

EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)

FAB：快速原子轟擊(MS)

FD：場解吸附(MS)

h：摺合板高，等於H/dP(式2.11)

HB：羥基苯甲酸(hydrxybenzoic acid)(圖7.8，7.17與7.19)

HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyric acid)

IPA：異丙醇(isopropanol)

kW：以水作為流動相的k值(式6.1)

LCEC：液相色譜電化學檢測器

LD：激光解吸(MS)

LSIMS：液態二級離子質譜

MALDI：基質輔助激光解吸電離

MP：對羥苯甲酸甲酯

[P-]m：流動相中離子對試劑P-的濃度(mmol/L)

PAD：脈沖電流分析檢測器

PBP：極性鍵合相

PD：等離子解吸(MS)

PP：對羥苯甲酸丙酯

PTH：乙內醯苯硫脲

R+，R-：分別為陰離子與陽離子離子交換色譜柱中的荷電功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]

RF：響應因子

TBA+：四丁基銨離子

tBME：見MTBE

TMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也為C1)

TNB：1，3，5-三硝基苯(1，3，5-trinitrobenzene)

TOF MS：時間飛行質譜

TSP：熱噴霧(MS)

u：流動相通過色譜柱的速度(cm/s);等於L/to

V：峰底寬(mL)

Vc：色譜柱內峰展寬對V的貢獻;也作小樣品量峰底寬(mL)(式2.16)

VR：保留體積(mL)

W：峰寬(min)(式2.12)

Wc，WS，：分別為色譜柱，進樣器，連續管和流通池對W的貢獻(min)

Wlc，Wfc：(式2.12)

X，X1，：無特徵結構的溶質(圖7.8，7.17和7.19)

X2，X3

XB：流動相中的B溶劑的摩爾分數

V：摺合速度，等於udp/Dm(式2.11)

б：高斯曲線的標准偏差;等於峰底的1/4

ι：檢測器響應時間常數(S)

φ：流動相中B溶劑的體積分數;等於0.0

⑥ 層析的常用層析

◆吸附層析
吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、澱粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用於能溶於有機溶劑的有機化合物的分離，較少用於無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統，以獲得最佳分離效果。
◆分配層析
在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和澱粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。
◆離子交換層析
支持物是人工交聯的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用於能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對於蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離後，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區帶。
◆凝膠過濾層析
支持物是人工合成的交聯高聚物，在水中膨脹後成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周圍的水為外水層。控制交聯度以形成不同孔徑的網狀結構。交聯度小的孔徑大，交聯度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小於孔徑的分子進入，大於孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區帶。選擇不同規格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯醯胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。
◆親和層析
在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯結在支持物上，用於純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。
◆氣相層析
屬於分配層析或吸附層析，僅適用於分析分離揮發性和低揮發性物質。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環氧類聚合物。外塗層約為支持物重量的20%。分析時操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區帶十分清晰，是由於揮發性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數分鍾至10餘分鍾。檢測記錄系統繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優點。氣相層析也能用於分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。
◆紙層析
以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用於分析簡單的混合物時可做單向層析。對於復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創了近代層析的發展和應用的新局面。70年代以後，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。
◆薄層層析
在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚醯胺等，根據需要做不同類型的層析。聚醯胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解於濃甲酸中，塗在滌綸片基上，當甲酸揮發後，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優越在於分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用於定性分析。也能用於定量分析和制備樣品。
◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）
70年代新發展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當於34個標准大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上塗一層1～2微米的二氧化硅，經硫醯氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用於制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鍾到10餘分鍾。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適於分析分離不揮發和極性物質。而氣相層析只適用於揮發性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫葯學和環境科學的研究中發揮了重要作用。
◆反相層析
在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發生拖尾現象和保留時間長的問題。如果在支持物上塗上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。
◆同系層析
在核酸分析中，將樣品經核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記後，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。於是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用於寡核苷酸的順序分析。
紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基於被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。
層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用於少量物質的分析鑒定，又可用於大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用於科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫葯衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
層析根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質的層析。

⑦ 層析法的主要操作

HPLC培訓教程
我國葯典收載高效液相色譜法項目和數量比較表：
方法 項目 數量
1985年版 1990年版 1995年版 2000年版
HPLC法 鑒別 9 34 150
檢查 12 40 160
含量測定 7 60 117 387
鑒於HPLC應用在葯品分析中越來越多，因此每一個葯品分析人員應該掌握並應用HPLC。

I．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶於流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由於與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先後從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。後來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
二、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓—壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速—流速為0.1~10.0 ml/min。
高效—可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度—紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快—通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
解析度高—可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高—紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用—用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收—樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。(此外還有電泳。)
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

被分離組分在柱中的洗脫原理