離子交換柱蛋白質提純

① 設計一個ph穩定范圍已知的蛋白分離純化實驗，利用那個類型的離子交換柱

如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定內離子交換。容
此時就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

② 蛋白質分離提純方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(2)離子交換柱蛋白質提純擴展閱讀：

吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜層析

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。

層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

③ 蛋白質提取分離純化鑒定的實驗方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞，上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，將乳糜粒吸出,留其餘液體備用。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1。21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min，此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品，將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面。柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加雙縮脲2滴，出現藍色混濁即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡於緩沖液中約30min後，方可用於電泳。
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關緊。
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區。
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均勻塗在加樣器上，再將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術後再正式點樣。
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA)。通電10—15min後，將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA)，電泳時間約50—80min。電泳後調節旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中，浸染5min，取出後再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹乾。
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出後立即緊貼於干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然乾燥，或用吹風機冷風吹乾且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區帶著色清晰，可用於光吸收計掃描。長期保存不褪色。
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後，可顯示出區帶，未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定。可採用洗脫法或光吸收掃描法，測定各蛋白組分相對百分含

④ 離子交換柱的工作原理

離子交換柱的工作原理：
採用離子交換方法，可以把水中呈離子態的陽、陰離子去除。
以氯化鈉（NaCl）代表水中無機鹽類，水質除鹽的基本反應可以用下列方程式表達：
1、陽離子交換樹脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、陰離子交換樹脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
陽、陰離子交換樹脂總的反應式即可寫成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分別被樹脂上的H+和OH-所取代，而反應生成物只有H2O，故達到了去除水中鹽的作用。
離子交換柱（ion exchange column）是用來進行離子交換反應的柱狀壓力容器。充填有離子交換樹脂的細長管柱。可由玻璃、不銹鋼、有機玻璃等不被所用的流動相腐蝕的材料製成。離子交換柱（混床）的分類：混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
離子交換柱的分類：
混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
1、體外再生混床適合小流量、對環保有嚴格要求的企業。但由於體外再生式混床配套設備多，操作復雜，現在已很少使用。
2、體內再生混床和陰樹脂外移再生混床適合大流量，有專門的水處理操作人員及廢水處理的場合。體內再生混床在運行及整個再生過程均在混床內進行，再生時樹脂不移出設備以外，且陽、陰樹脂同時再生，因此所需附屬設備少，操作簡便。
3、陰樹脂外移再生混床：陰樹脂外移再生式混合床及其配套的陰樹脂再生柱基本構造與小型逆流再生固定床大致相同，陰樹脂再生柱厚度較混合床小，所需的膨脹高度為樹脂層高度的50%～60%，故再生柱可較低，但一般為統一起見做成與混合床相同。

⑤ 蛋白質純化所用的柱子有幾種，分別有什麼作用

一、沉澱法

1、 鹽析

實驗原理：中和蛋白質表面電荷並破壞水化膜。

蛋白質易溶於水，因為其分子的-COOH -NH2和-OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍於蛋白質分子周圍形成1~100 nm大小的親水膠體，從而削弱了蛋白質分子之間的作用力。當大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO42- 和NH4+）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之"失水"，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。

2、等電點沉澱法：

實驗原理：利用蛋白質在等電點時溶解度最低而各種蛋白質又具有不同等電點的特點進行分離的方法。

在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉澱，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉澱物。

注意點：不同的蛋白質，具有不同的等電點。同一種蛋白質在不同條件下，等電點不同。

3、有機溶劑沉澱法

實驗原理：加入有機溶劑使水溶液的介電常數降低，因而增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促進了蛋白質分子的聚集和沉澱。

有機溶劑引起蛋白質沉澱的另一種解釋認為與鹽析相似，有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質脫除水化膜，而易於聚集形成沉澱。

影響因素：(一)有機溶劑的選擇 (二)溫度的控制 (三)pH值 (四)離子強度

用此法析出的沉澱一般比鹽析法易過濾或離心沉降，分離後的蛋白質沉澱應立即用水或者緩沖液溶解，以達到降低有機溶劑的濃度的目的。此法在血液製品的制備過程中較多使用。

二、層析

1、離子交換柱層析

實驗原理：以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。是發展最早的層析技術之一，目前已成為蛋白質分離純化最常用的手段，是基於蛋白質電荷不同的分離技術。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

2、疏水相互作用層析

實驗原理：根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。

蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由於疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。

3、親和層析

實驗原理：利用蛋白質能和某些專一分子可逆結合的特性，

當蛋白質溶液通過層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合，不被吸附的無關成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質分開。此法特異性強，收率高。

4、凝膠層析

實驗原理：根據分子大小分離蛋白混合物的最有效的方法之一。混合物隨流動相流經裝有凝膠固定相的層析柱時，其中各物質因分子大小的的不同而被分離的技術。

三、離心

1、速率區帶離心法

實驗原理根據分離的粒子在離心力作用下，因其在梯度液中沉降速度的不同，離心後具有不同沉降速度的粒子處於不同的密度梯度層內，形成幾條分開的樣品區帶，達到彼此分離的目的。

由於此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。容量小，只能用於少量的制備。

2、差速離心法

實驗原理：利用樣品中各組分沉降系數的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經過多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實現離心分離。

四、膜分離

1、超濾法

是利用加壓膜分離技術，在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製薄膜，大分子溶質滯留，從而使大分子物質得到部分的純化。常和離子交換，凝膠過濾聯合使用。

2、透析

是利用小分子經過半透膜擴散到水( 或緩沖液) 的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術，常和鹽析，鹽溶等方法聯合使用。

⑥ 離子交換柱的工作原理是什麼

離子復交換柱的原理制

採用離子交換方法，可以把水中呈離子態的陽、陰離子去除，以氯化鈉（NaCl）代表水中無機鹽類，水質除鹽的基本反應可以用下列方程式表達：

1、陽離子交換樹脂：R—H+Na+→R-Na+H+

2、陰離子交換樹脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+

陽、陰離子交換樹脂總的反應式即可寫成：

RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O

由此可看出，水中的Nacl已分別被樹脂上的H+和OH-所取代，而反應生成物只有H2O，故達到了去除水中鹽的作用。

3、混合離子交換柱（混床）：混床是裝陽、陰樹脂按一定比例（一般為1:2,以便陽、陰樹脂同時達到交換終點而同時再生）裝入混合柱而成，實際上它組合成了水中的H+和OH-立即生成電離度很小的水分子（H2O）,幾乎不存在陽床或陰床交換時產生的逆交換現象，故可以使交換反應進行得十分徹底，因而混合床的出水水質優於陽、陰床串聯組成的復床所能達到的水質，能製取純度相當高的成品水。

⑦ 設計一個利用陰離子交換柱純化一個等電點為7.5的蛋白質的實驗

既然是抄陰離子交換，就要讓目標蛋白帶負電，那麼緩沖液PH就要大於等電點。緩沖體系的選擇也很重要，一般用TRIS-HCl，特別是弱陰離子柱不可選用帶負電強的磷酸鹽緩沖液，否則上樣液中被交換的將是磷酸根而不是目標蛋白。一般用NaCl平衡後上樣進行離子交換，然後再用較強的陰離子洗脫。

⑧ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。