超濾管離心後外泌體在哪裡

㈠ 細胞外泌體是什麼

外泌體——是一類有細胞釋放的細胞外囊泡。外泌體的特點見正文。

細胞外囊泡——簡稱EV，是由細胞釋放的各種具有膜結構的囊泡結構統稱，這些囊泡的直徑可以從30、40nm到8、9um。細胞外囊泡有不同的亞群，而目前研究最火熱的是外泌體這個亞群。

然而由於目前很難純化到非常純的外泌體亞群，人們純化到的通常是直徑小於200nm的囊泡，因此越來越多的人開始稱之為sEV（即 small extracellular vesicle，小細胞外囊泡）。為了嚴謹，所以今天我們也以細胞外囊泡來稱呼這些膜泡結構。本文中沒有特殊說明的情況下，細胞外囊泡主要指外泌體和微囊泡。

今天主要介紹內容包括細胞外囊泡的研究意義、細胞外囊泡的分類、細胞外囊泡含有的成分、細胞培養上清的制備、細胞外囊泡的保存、細胞外囊泡的鑒定實驗要求。所有內容都參考目前已發表的綜述，並非hzangs杜撰。所以請新朋友們放心學習。

細胞外囊泡的研究意義
目前，細胞外囊泡的功能還沒有完全闡明。已有的報道認為它們能夠調節宿主-病原體的相互作用，參與傳染性和炎性疾、神經疾病和癌症等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發揮著介導細胞間通訊的重要功能，已有文章報道細胞外囊泡在發育中也發揮著重要作用。細胞外囊泡在臨床醫學中也有十分光明的應用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標志物，可用於監測臨床狀態，治療反應，疾病進展等，同時由於它們具有遞送生物分子的功能，因此它們還有發展成臨床葯物遞送載體的潛力。

細胞外囊泡的分類
細胞外囊泡—這個詞是由國際細胞外囊泡學會（ISEV）創造的術語，根據細胞外囊泡的生物合成或釋放途徑可以對囊泡進行分類：外泌體（exosomes）直徑為30-150nm，起源於內吞途徑，其密度約為1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接從質膜釋放，直徑約100-1000nm；凋亡小體（apoptotic body/bleb）直徑約為50nm-2μm，由細胞凋亡產生；腫瘤小泡（large oncosomes）直徑約1-10μm，由腫瘤細胞釋放產生；以及其他各種EV亞群。由於不同EV亞群的大小以及它們的所包含的生物分子存在差異，因此現在已經有幾個小組開始表徵EV亞群的組成。最近的論文聲稱，基於一般表面蛋白質組學分析或個別EV群體的轉錄譜，對細胞外囊泡進行了成功的亞群分類。目前可以通過差速離心、過濾、免疫親和、層析、流式細胞分選、密度梯度離心選取不同密度區域等多種手段大致分離不同的細胞外囊泡亞群，但是這些方法都不能完全純化到特定的亞群，分離到的通常是富集了某一個亞群同時帶有其他細胞外囊泡亞群。

細胞外囊泡含有的成分
細胞外囊泡的組成成分並不是隨機的，每一個細胞外囊泡都會攜帶特定的分子信息。 實際上，這些納米尺寸的細胞外囊泡能夠攜帶蛋白質，脂質，核酸和糖等生物活性分子在細胞間傳遞信號，並且其包裝的獨特分子構成決定了要傳遞給受體細胞的細胞外信號的類型。有一個復雜的分選系統來決定那些分子能夠進入細胞外囊泡。

細胞培養上清的制備
目前有兩個策略來制備細胞培養上清用於提取細胞外囊泡。使用去除細胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培養基培養細胞和使用不含FBS的培養基培養細胞（血清飢餓細胞）。但是目前一些高水平的文章報道使用的方法通常是前者。另外，有些文章開始關注去除細胞外囊泡的胎牛血清中游離RNA對實驗結果的影響，但是目前並沒有形成共識。如果需要先儲存培養上清，一定量後再用於細胞外囊泡分離，那需要預先去除體系中的死細胞和細胞碎片。

細胞外囊泡的保存
Lőrincz等人曾對中性粒細胞來源的細胞外囊泡做了不同條件的儲存，之後再去分析這些囊泡的特性，他們發現雖然細胞外囊泡樣品中囊泡數量和形態沒有明顯變化，但即使是儲存在-20或-80攝氏度情況下的細胞外囊泡也存在磷酯醯絲氨酸外翻明顯增多的情況；但他們同時也發現，尿液來源的細胞外囊泡並沒有這些變化。Kalra等人分離了來自結直腸癌細胞的細胞外囊泡，不同條件保存一定時間後進行PKH67染色跟蹤細胞外囊泡的攝取，分析發現這些囊泡依舊可以被細胞攝取。就目前的情況，學者們並未就儲存條件對細胞外囊泡是否有影響達成共識。因此建議大家實驗時分離細胞外囊泡後盡快用於實驗，盡量減少儲存過程。

細胞外囊泡的鑒定及實驗要求
根據國際細胞外囊泡協會於2014年發表的一個指導手冊（MISEV），鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定細胞外囊泡的標志蛋白是否存在於樣品中，通過電子顯微鏡來觀察樣品中細胞外囊泡的形態特徵，通過NTA等手段來分析樣品中細胞外囊泡的群體特徵（粒子濃度、直徑分布等）。

今天就先介紹到這里。細胞外囊泡領域作為生物學研究中的一個新興領域越來越受到學者和生物公司的關注，也有越來越多的研究報道出現。但是我們也要清楚的認識到該領域的研究技術依舊不完善，對細胞外囊泡的認識依舊不充分，細胞外囊泡研究依舊處於一個起始階段，要走的路還很長。

㈡ 外泌體來自哪裡

外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋搏燃白質的小膜泡 (30-150nm)，現今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次於綿羊網織紅細胞中被發現， 1987年Johnstone將其命名為「exosome」。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源於細基敗胞內搏銀顫溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合後釋放到胞外基質中 。

所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在於體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。 有關他們分泌和攝取及其組成、「運載物」和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究。 外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用於微創診斷的開發。

㈢ 外泌體是什麼

外泌體於1983年首次被發現，是由於細胞膜內吞形成內體，內體限制膜發生多處凹陷，向內出芽形成微囊泡，從而形成的具有動態亞細胞結構的多囊泡體。大多數類型的細胞均可分泌外泌體。構成外泌體的主要成分為蛋白質、核酸和脂質。外泌體有多種分泌途徑，對細胞間通信、疾病的傳播及組織修復具有重要的調節作用。外泌體與受體細胞的結合方式多種多樣，外泌體可以將膜蛋白或其內容物轉移至受體細胞，也可以直接與受體細胞膜融合；此外，外泌體上的跨膜蛋白還可以直接作用於受體細胞膜表面伍搜的信號分子。外泌體廣泛存在虛困於生物體的免疫應答反應中，外泌體可以通過介導促炎症反應來促進免疫反應，腫瘤細胞分泌的外泌體還可以抑制免疫反應。腫瘤細胞分泌的外泌體可以促進癌症的侵襲和轉移，加快癌症部位的血管生成，有助於腫瘤微環境中的上皮間充質轉化，並且增強腫瘤的耐葯性。外泌體通過與受體細胞特異性結合的方式，傳遞各種生物學信息，發揮重要的生差橘念物學作用。

㈣ 實戰分享 | 外泌體提取之經驗小結

近些年來，關於外泌體的研究如火如荼。外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等生理病理上起著重要的作用。同時，不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。 來自華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院的崔老師，對外泌體提取積累了自己的心得，並將自己的研究成果發表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老師的分享。

要進行關於外泌體的研究，提取純化外泌體一直是大家非常關注的問題。 能否獲得較高純度的足量外泌體，直接關系著後續研究能否開展 。雖然目前仍然沒有能同時保證外泌體的含量、純度和生物活性的提取宏氏方法，但是我們可以結合當前的實際情況，對外泌體提取做一些探討和經驗總結。

超速離心（差速離心）法是目前最常用的外泌體提取方法 ，即採用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎。本人近期發表的論文中最後也是採用了這種方法。

具體的步驟大家都比較熟悉，無論是提取血清來源的外泌體，還是細胞條件培養基來源的外泌體 ，大家都習慣於先將血清或者條件培養基收集後保存於-80℃的溫度下，等達到一定量後，再批量進行超速離心。

這樣的話， 大家會發現一個非常嚴重的問題，尤其是在拍攝電鏡的時候——背景雜質很多，並且很多囊泡的形態不夠典型，不鎮絕雀是文獻中描述的那種典型的雙凹圓盤狀或者茶托狀。

通過幾次實驗的對比，我大概發現了原因， 主要是由於在凍存收集到培養基的時候，沒有進行低速離心和普通高速離心。

低速離心可以去除培養基中的未貼壁細胞、死細胞以及大的細胞殘骸，而普通高速離心可以去除其中的大型細胞外囊泡。無論是未貼壁細胞、死細胞、大的細胞殘骸，還是大型細胞外囊泡，在-80℃凍存及復溫的過程中，都會發生破裂，產生小型的細胞膜碎片結構。

這樣的話，就導致了電鏡背景很雜亂，難以達到高水平論文雜志期刊的要求。另外，還會導致這御早樣一個矛盾現象，即蛋白定量中計算的外泌體產量虛高，而蛋白免疫印跡中外泌體標記物蛋白的含量卻不高。

因此，在這里推薦給大家一個小貼士

就是在收集准備提取外泌體的條件培養基或者血清時，一定要提前做到低速離心和普通高速離心這一步，尤其是為了做透射電鏡或者蛋白免疫印跡實驗而提取的外泌體 ，一定要注意這一點。盡管過程比較費時，但是能生產出有用的結果才是更重要的。

至於其他的外泌體提取方法，如密度梯度離心、色譜柱、超濾離心法、微流控晶元法、磁珠免疫法、多聚物沉澱法，我看到學校裡面鮮少有人去嘗試，畢竟更麻煩。但不同的方法各有優劣，大家可根據自己的實驗，謹慎選用。

㈤ 離心管和離心超濾管

離心管就來是一個簡單的可自以承受高轉速壓力的管子，比如離一些樣品，分離出上清沉澱。
離心超濾管會有一個類似於內管和外管的兩個部分，內管中是帶有一定分子量的膜，當高速離心時，分子量比它小的就漏到下面的管子（即外管）中了，分子量比它大的就截留在上面（即內管中），就是超濾的原理。。。。常用於濃縮樣品。

㈥ 什麼是外泌體

通過上述科普，大家對外泌體美容一定有了更全面的認識

㈦ 超濾離心管怎麼使用

蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。

㈧ 超濾管離心後為什麼還剩餘液體

題主是否想詢問「超濾管的使用方法」？
1、選擇合適的超濾管，主要考慮蛋白分子量和濃縮體積。
2、新超濾管使用前加入純水，水量完全過膜，冰浴或者冰箱里。
3、使用過的超濾管先倒出內涵乙醇，然後用純凈水沖洗干凈，
4、質量和重心都達到平衡。

㈨ 外泌體提取策略

外泌體即細胞外囊泡（簡孫納卜稱EVs）是所有細胞主動分泌的納米級囊泡,活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環境進行細胞間交流,細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物｡根據相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類,直徑在50-150nm的外泌體,直徑在100-1000nm的微囊泡､外粒體和微顆粒,直徑在-100-5000nm的凋亡小體｡目前主要認為,外泌體產生的過程是細胞膜內陷形成內體,再形成多泡體,多泡體與質膜融合導致其管腔內囊泡釋放到細胞外,產生一種稱為外泌體的EV亞型｡

2 外泌體的提取純化方法

2.1 基於密度的分離方法

2.1.1 超速離心法

超速離心法是最常用的外泌體提取方法,首先,施加較低速度的離心力300g以從細胞培養液中去除細胞;然後,對上清液施加較大的離心力(10000-20000g),去除大的細胞碎片和破碎的細胞器;最後,再次進行高速(100000-150000g)離心從 上清液 中收集外泌體,所有離心在4℃下進行｡超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染,且分離數量多,處理樣本小｡盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的「金標准」,但仍然有很多缺點,如所需的超高速離心儀器比較昂貴､樣品量大､耗時長､電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度離心法

目前已發現,外泌體在蔗糖梯度為1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根據這個特性,可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心,外泌體沉降到不同的密度區域就可以將其區分出來｡蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續梯度濃度的蔗糖溶液,將蔗糖溶液鋪於離心管底部,再將樣本放於上部,4℃下100000g超速離心｡蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高,但是前期准備復雜,耗時長,又不能完全將外泌體與蛋白質分離開｡2013年10月ISEV會議一些研究人員表示,通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時,細胞囊泡的生物功能喪失｡

2.2 沉澱法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一種水溶性非離子化合物,具有極強的親水性,可以與疏水的脂質雙分子層結合,從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉澱｡RIDER等研究發現,PEG水平會影響外泌體的產率,且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數量和質量上足以用於蛋白質組學和測序分析｡沉澱法操作簡單,不需要特殊設備,更經濟,外泌體產量高,但是會沉澱一些非外泌體的疏水性物質而導致外泌體純度不夠｡

2.2.2 試劑盒法

最近已經開發出基於聚合物共沉澱的試劑盒,如ExoQuick､TEI等,可用於提取多種體液中的外泌體｡聚合物沉澱劑ExoQuick與樣品4℃共孵育30min,然後室溫1500g離心30min,即可獲得外泌體沉澱｡與超速離心法比較,試劑盒法更簡便､耗時短,且能獲得更高的外泌體產量｡試劑盒法獲得外泌體沉澱含有的雜質較多,不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取,且試劑盒價格較貴｡

2.3 基於大小的分離方法

2.3.1 SEC SEC

主要根據外泌體的大小對外泌體進行分離和純化｡樣品中大分子物質不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來,尺寸小於孔徑的物質可進入多孔材料,需要較長時間被洗脫出來,即可通過不同的洗脫時間分離外泌體｡BING等證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體,通過這種方法茄吵,外泌體很容易從蛋白質和高密度脂蛋白中分離出來｡HONG等通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體,與漫長而復雜的超速離心法不同,它可在30min內完成外泌體分離｡通過SEC分離的外泌體純度較高,分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基於微型SEC分離的重要優勢,但數量較少,而且需要特殊設備,故應用不廣泛｡

2.3.2超濾法

超濾法是根據外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜,將樣品中小分子物質過濾到膜的另一側,而將大分子物質滯留在膜上來達到分離的目的｡超慮法簡單､省時､成本低｡LIU等改則穗良了簡單的超濾法,通過將不同孔徑的膜(200､100､80､50､30nm)串聯在一起,實現了不同大小外泌體的快速分離,且捕獲效率明顯高於超速離心法｡然而,過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質堵塞,這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎｡

2.4 基於表面成分親和力的分離法

2.4.1 蛋白質

外泌體表面含有豐富的蛋白質,所以基於其表面成分的親和力特別適合於分離外泌體｡CD63是外泌體中發現的最豐富的蛋白質之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌體｡ZHAO等通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合,將外泌體捕獲到磁珠上後,加 緩沖液 沖洗5min,然後引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24､抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖類抗原-125(抗CA-125)],通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平｡

2.4.2 膜磷脂

雖然大部分基於表面成分的親和方法是基於外泌體表面的蛋白質,但是脂質雙層也是一種很好的檢測目標｡XU等利用外泌體膜上表達的磷脂醯 絲氨酸 (PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合,用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲,並且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態,與商業外泌體提取試劑盒相比,表現出更高的捕獲率｡CHEN等利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點,使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應,血漿中的外泌體就能與磁珠結合,通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質蛋白｡

2.5   ACE分離法

ACE微陣列產生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產生的,納米級的粒子和其他納米級實體物質被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區域,細胞和大的實體物質被吸引到DEP低場區域｡ IBS EN等的ACE裝置需要30-50μL血漿樣品就能夠在15min內將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區域｡ACE設備流程明顯快於目前使用的方法,這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力,明顯減少了加工步驟和消耗時間｡CHEN等構建了具有交叉電極的DEP晶元,能在30min內從血漿樣品中分離出外泌體｡經過測試證明,DEP晶元具有高捕獲率和高回收率,需要的時間更短,並且不需要笨重和貴重的儀器｡

2.6 微流控晶元法

微流控晶元法是新開發出來的用於快速高效分離樣品中外泌體的方法｡WOO等使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30min內實現了20-600nm外泌體的全自動富集｡使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養上清液中外泌體的回收率大於95%｡與超速離心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省時,所需樣本量更少｡FANG等開發了一種微流體晶元,將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入晶元,在第1個腔室中捕獲到外泌體,通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合,再通入熒游標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室｡微流控晶元法操作簡單,捕獲率高,特別適合於生物學研究｡外泌體作為癌症診斷的有前景的生物學標志物,其在癌症的液體 活檢 中受到關注｡外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性｡相信隨著技術的不斷進步和創新,外泌體提取將變得更加簡便經濟,純度越來越高,完整性越來越好｡

提取後往往需要進一步檢測，確定提取的是不是外泌體。有三種方法：1. 掃描電鏡觀察；2. NTA儀器粒徑檢測；3. WB檢測。如圖所示，在外泌體上往往存在許多標志物，這時候就可以選擇相應的抗體進行WB檢測。根據22 篇外泌體相關文獻的統計，排在前4 位的檢測指標為 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81並列第三位（6/22）；接著檢測較多的4 個指標為Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1 篇文獻中出現過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發表需要了，比如檢測CD63 和Tsg101。 

㈩ 再生醫學材料的黃金搭檔：外泌體與細胞外基質

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外泌體的概念

上世紀80年代，外泌體首次被科學家發現，並且在很長時間內被認為是細胞的代謝產物。由於當時分析和研究的手段受限，外泌體的功能並不明晰。直到21世紀，科學家們才通過各種新技術，分離和提取出外泌體，並發現 外泌體在細胞之間充當重要的溝通介質，進而影響細胞而至組織的生理活動。

細胞可以通過分泌細胞外囊泡與臨近細胞或者遠端細胞進行通信，而外泌體正是其中一類尺寸小於200納米的細胞外囊泡。外泌體是在多泡核內體或多泡體中產生的，並在這些囊泡與質膜融合時分泌。外泌體由與細胞類似的磷脂雙分子層組成，該雙分子層含有跨膜蛋白和胞質蛋白和RNA；外泌體的內部包含一系列蛋白質 （胞質、骨架和生長因子） 和傳遞特定功能線索的miRNAs。因此，外泌體可以通過其表面的磷脂雙分子層上蛋白靶向到受體細胞。外泌體一旦附著在靶細胞上，可通過受體-配體相互作用誘導信號轉導，或通過內吞汪攜和/或吞噬作用內化，甚至與靶細胞的細胞膜融合，將其內容物傳遞到靶細胞的胞質中，從而改變受體細胞的生理狀態。外泌體具有良好的生物相容性，不易在機體內引發免疫排斥反應。

- 02 -

外泌體的提取

所有的細困返伏胞都可以分泌外泌體，機體的體液內和間質中均含有大量的外泌體。由於生物體內所含有的細胞或者蛋白非常豐富，因此從體內提取外泌體是非常困難的，而且外泌體來源的細胞也無法確定。

現如今有兩類廣泛使用的用於提純外泌體的方法：超速離心法和Thermo Fisher等公司生產的提純試劑盒。

超速離心法，主要是通過將實驗室培養幹細胞所得到的培養基通過濾膜濾掉尺寸較大的細胞碎片及細胞外囊泡後，通過超速離心機在100,000g的離心力的作用下富集得到外泌體。

提純試劑盒，主要是通過試劑包被外泌體，使其尺寸和重量增大，從而在10,000g的離心力即可得到外泌體。試劑盒的使用有導致外泌體污染的風險，在科研領域超速離心法更為常見。

- 03 -

外泌體的生物學特性

由於外泌體在再生醫美領世顫域顯示出極大前景，這也迎來產業化合作的新浪潮，眼下外泌體似乎已經成為下一個生物醫葯的黃金賽道。科學家們普遍認為， 外泌體具有其獨特的生物學特徵，可以反映來源細胞的表型 。

圖 5 外泌體促進皮膚修復

不同細胞分泌不同的外泌體，因此外泌體的應用是多種多樣的。一方面， 外泌體被認為是多種癌症的疾病診斷生物標志物。 外泌體獨特的miRNA譜圖和疾病載體作用，使得其頻繁出現在卵巢癌、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和結腸癌。另一方面， 外泌體也可以作為細胞信號傳導的有效媒介而廣泛用於醫學再生領域。 例如，它們能夠將RNA和蛋白質的信息從來源細胞轉移到周圍環境中的其他細胞。實驗證明，來自小鼠胚胎幹細胞的外泌體在體外促進了小鼠造血幹細胞的存活和擴展，同時也上調了受體細胞中與多能性相關的轉錄因子。幹細胞來源的外泌體與生物材料相結合，促進骨組織以及關節軟骨的修復和再生。

在皮膚組織再生中，外泌體的應用尤其廣泛。 如脂肪源外泌體能通過減少IFN-α的分泌而發揮免疫抑製作用，從而抑制T細胞的激活。此外，外泌體含有免疫調節蛋白如TNF-α、巨噬細胞集落刺激因子 （MCSF） ，從而通過良好的炎症調節保證了傷口癒合。而在皮膚癒合過程中，外泌體則能通過優化成纖維細胞特性加速皮膚傷口癒合。在一項研究中發現，外泌體上調199個miRNA，下調93個miRNA，促進真皮成纖維細胞增殖和分化，加速皮膚再生。

圖 6 外泌體促進皮膚細胞增殖

總而言之，幹細胞來源的外泌體作用廣泛。 在皮膚再生中，外泌體可以通過調控炎症、促進皮膚修復等多方面提供作用；在疾病發展中，外泌體也參與多種病理通路。 在未來，無論是組織再生、皮膚修復、還是疾病研究，外泌體都將在其中扮演重要角色。

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外泌體的缺陷

外泌體具有諸多優點，在醫用再生中具有難以忽視的價值。然而，外泌體的應用卻還有所局限。

最適用於提純外泌體的超速離心法，在提純得到外泌體的過程中會導致大量的外泌體損失，至少80%的外泌體會因為收集的損失或者在超離過程中其獨特的磷脂雙分子層的膜破碎而無法維持其正常形態。

此外，外泌體在提純後其保存比較困難，需要保存的試劑具有與體液類似的滲透壓從而維持其磷脂雙分子層的膜結構，否則其內含的具有生物功能的蛋白質和miRNAs也容易失去活性。另外，外泌體起到信號傳導作用，但本身並不會提供結構支持。因此，在修復領域，外泌體難以單獨使用。

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細胞外基質：外泌體的最佳搭檔

所有細胞均可分泌外泌體，外泌體充當著細胞之間信息交流的介質，因此外泌體生理功能的實現是通過一個細胞「出」而「進」入到另一個細胞內。在組織內部，必然要穿越細胞外基質。

因此，外泌體更適合作為細胞外基質的一部分來發揮價值，而細胞外基質的獨特生理結構和生理穩態一來可以幫助維持外泌體的活性、二來也能與外泌體協同作用，實現更好的修復和再生效果。

細胞外基質是外泌體最理想的載體

在醫用再生領域，科學家們研究各種各樣的生物材料，並與外泌體進行復合促進組織的修復和新生。細胞外基質無疑是最安全的並且可以與外泌體協同發揮作用的生物材料。細胞外基質本身即源於人體，具有多元的組成 （膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白等等） 。

一方面， 細胞外基質能夠起到結構支持作用，作為承載材料提供組織再生的根基 ；另一方面， 細胞外基質中復雜的結構和靶點可以維持外泌體的活性，從而高效發揮外泌體的性能 。外泌體可以通過進入細胞內發揮其優異的生物學功能， 而細胞外基質作為載體即可以為細胞的黏附和遷移提供平台。如果沒有細胞外基質所提供的平台，那麼外泌體會很快隨著體內的生理循環和代謝而流失，從而失去了其作用效果。眾所周知，外泌體價格昂貴。 當外泌體由細胞外基質承載、由細胞外基質保護時，才會更好地提高其生物利用度 ，取得更好的修復效果。

細胞外基質提供適應的修復微環境

組織修復和再生，與細胞微環境息息相關。簡單來說，微環境由兩個基本組成部分組成，一個是細胞外基質 （ECM） ，而另一個是細胞分泌的外泌體、生長因子等功能性物質。二者缺一不可，彼此相輔相成、緊密結合。因此，光有外泌體，沒有細胞外基質是遠遠不行的。

其實，除去細胞外基質 對外泌體的負載和保護作用，其本身也具備出眾的再生和修復能力 。除了提供細胞存在的平台，細胞外基質的多元組成既可以為細胞的生理活動提供養分，並駐留在原位，成為機體自身的細胞外基質的一部分；又能夠通過其本身的生物學特性來協同外泌體，實現更好的修復和再生效果。在經典的修復再生過程中，細胞外基質可以調節幹細胞的表型和表達，而外泌體則含有控制幹細胞分化的表型特異性指導因子 （miRNA，RNA和蛋白質）。

簡而言之， 細胞外基質可以從拓撲結構、生物力學、功能靶點等多個維度與外泌體、生物因子共同作用，從而形成適於組織修復的胞外微環境。

首先，細胞外基質所含有的多種蛋白、多糖成分構建出其獨特的三維結構和表面拓撲學特徵。除支撐組織的生理形態外，還能夠調控募集細胞的黏附、增殖和分化行為。近年來，人們更是發現細胞外基質構建的拓撲學結構與免疫細胞的免疫應答等行為息息相關，進而調控組織再生。

再者， 細胞外基質本身具有其獨特的生物力學性質 。不同彈性模量、不同硬度的基質，能夠引發細胞的不同表現行為和分化方向，也會引起細胞分泌和募集因子的不同。

細胞外基質極為多元的組成能提供不同的生物學效果，從而建立修復微環境 。舉例來說，細胞外基質中的纖連蛋白因可與細胞表面的整合素蛋白的α5β1結合，充當修復過程中細胞與細胞外基質交流溝通的重要參與者，並且調控細胞的黏附、增殖、形態和分化等行為；蛋白聚糖通過參與調節細胞外基質的組裝和維持，並通過與生長因子的相互作用參與細胞增殖等細胞行為，在組織的生理和生物力學功能中發揮重要作用。正是由於細胞外基質打下的堅實基礎，才能讓外泌體、細胞因子等活性成分進一步「錦上添花」。

另外，近幾年研究中還發現，細胞外基質的結構能結合和錨定多種生長因子（如VEGF，HGF等）、多肽短鏈。一方面， 通過構型調整來更好地發揮其生物活性 ；另一方面，則能 形成生長因子梯度，從而介導修復和再生過程的進行 。可以想像，這是唯有細胞外基質才能實現的高度復雜而有序的生物過程。相比之下，僅僅使用外泌體完全無法實現上述空間上的介導過程。這也解釋了為何直接使用外泌體或生長因子時，往往修復和再生效果並不如人所願。

關於細胞外基質和外泌體之間的作用，目前依然還在不斷研究中。然而，我們已經可以知道的是： 細胞外基質是組織再生的舞台，而外泌體則是舞台上的演員 。 演員可以讓舞台更加 熠熠生輝 ， 但舞台卻是整個根基所在 。 二者有機結合，則能帶來最好的演出效果。

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細胞外基質/外泌體組合的應用

目前，細胞外基質/外泌體這一組合有了不少應用實例，其作用效果極為明顯。

國外的研究中， 以細胞外基質中的膠原為支架組成並負載外泌體。 這一體系增加了外泌體在體內的保留時間、延長了釋放過程，同時也在心臟組織的修復中取得了更好的效果。無獨有偶，在另一項研究中，科學家則利用了仿細胞外基質的絲蛋白/殼聚糖復合體系，並通過慢性糖尿病患者皮膚創面癒合模型來考察了作用效果。可以發現， 這一仿細胞外基質和外泌體體系具有協同作用，能加速皮膚創面再生。

而國內的部分研究則更進一步，將「全成分」的細胞外基質、玻尿酸、外泌體結合，並考察了其在人體上的作用效果。從臨床實驗中可以發現，該體系能夠顯著淡化眼紋，令眼部更顯年輕態。隨著年齡的增加， 部肌膚膠原蛋 流失增加，彈性纖維 化斷裂，基底層上真皮與表皮連接不再那麼緊密。於是乎，就產生了各類細紋。而通過細胞外基質、玻尿酸、外泌體這一復合體系，一方面外源性途徑引入了膠原、糖胺聚糖等重要基質成分，撐起來了眼周結構；另一方面通過其本身的生物學效應，內源性途徑增加細胞外基質分泌。通過雙管齊下的方式，迅速起效。

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文末小結

隨著技術的進步，外泌體已經越來越被人們熟知，其應用也愈加廣泛。外泌體是具有納米尺寸的細胞囊泡，具有高生物活性，能參與細胞之間的交流，調控炎症水平、促進組織再生。然而，外泌體提取較為困難，本身也不具備結構性的功能，因此單獨使用有所局限。

作為細胞外基質中的一部分，當外泌體回到細胞外基質中時，能夠發揮出更為強大的作用，更起到「錦上添花」的效果。細胞外基質一方面是外泌體最理想的載體，幫助維持外泌體的活性；另一方面細胞外基質能夠構建出最適宜再生的細胞外微環境，從而讓外泌體能更加有的放矢。

目前，國內外相關的研究正如火如荼地進行中。相信，不久的將來，細胞外基質/外泌體這樣的明星組合會越來越多地出現在我們面前。

參考文獻

誰持彩練當空舞 ：幹細胞基礎與臨床研究進展

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