超濾純化蛋白質

⑴ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.
常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.

⑵ 蛋白質分離純化常用的方法

1、沉澱
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的，在電場中能專向電場的正極或負極移動。根屬據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析： a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。 b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能同時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。

⑶ 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化 蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]. 2.根據溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等. 等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最 低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]. 蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]. 有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]. 萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]. 反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑 在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋 白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質. 3.根據電荷不同進行分離純化 根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類. 在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這 種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大. 離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]. 4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.

⑷ 蛋白質的分離方法

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。

2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。

⑸ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼

常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等

1. 離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。

2. 親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。

3. 電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。

4. 疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。
   

⑹ 如何進行蛋白超濾設備選型

如何進行蛋白超濾設備選型？在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。

供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .

為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.
2012-02-25
6
相關搜索
蛋白質層析純化蛋白質層析實驗蛋白質疏水層析蛋白質層析原理蛋白質的分子篩層析實驗蛋白質鹽析肽鍵斷裂嗎蛋白質層析的實驗操作蛋白質層析都要調電導嗎
研究蛋白質的技術手段
贊0答1
隨著新的技術手段不斷運用於生物膜的研究，科學家發現膜蛋白...，有的蛋白質是...在磷脂雙分子層中的。
贊4答2
正在載入...

⑺ 蛋白質分離提純方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(7)超濾純化蛋白質擴展閱讀：

吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜層析

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。

層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

⑻ 如何進行超濾膜離心純化蛋白

直接使用超濾的中空纖維膜即可，無需離心。

⑼ 超濾技術應用蛋白質的分離有何優勢

優勢：血漿蛋白分離採用超濾技術能使得生產工藝設計和設備單簡化;縮短了生內產周期;減少污容染;大大降低生產成本,提高了效益。

正超濾具備了純化和濃縮雙重作用,所以在血漿蛋白分離上被廣泛應用於脫鹽、脫醇、濃縮,分離提純,去熱原等方面。