1. 樣本前處理（三）
蛋白提取的質量控制
我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。
如上圖，質量控制分兩個部分：
含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。
SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。
以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。
我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：
情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；
情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；
情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。
情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。
脫鹽
蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。
超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。
Tips :
樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對樣品造成影響，我們提取蛋白時使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話，造成樣品體積太大，下一步加入酶後，則酶和蛋白的濃度會特別低，酶解效果受到很大影響。另外，體積太大處理起來也不方便。這時也可以使用超濾的方法，多步稀釋，將尿素的濃度降到1M以下。
透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。
丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉澱2個小時以上。
C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。
還原烷基化及酶解
脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：
這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。
首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。
烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。
另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。
酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。
Tips :
如果做iTRAQ（或TMT）標記，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系。因為iTRAQ（或TMT）試劑是標記末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會被標記上，影響蛋白的標記效率。
酶的用量可以參考以下的公式：
W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50
此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。
蛋白質及肽段的預分級
前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。
我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。
第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。
SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。
SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。
RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。
HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。
High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。
Tips :
通常，我們通過RPLC與質譜聯用。因為RPLC體系是用水和乙腈，易揮發，不含鹽，可以直接送入質譜進行檢測。而像SCX/SAX這類正相柱，需要通過高鹽的體系將樣品洗脫下來，所以它與質譜不兼容。我們在做多級分離時，前面都會有各種鹽的洗脫，最後才是RPLC，然後就可以直接連質譜了。
多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。
我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。
右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。
左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。
右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。
我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。
一篇2013年發表在MCP上的文獻報道，採用RP-RPLC兩級分離，分成常規的24個餾分，上樣量為100μg，在一天內能檢測到8000多個蛋白。
一篇2013年發表在Nat Comm上的文獻報道，先採用RP柱分級，再使用SAX分離，然後通過1米的長柱子反相色譜分離。樣品為人的胚胎幹細胞，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測了9818個蛋白，如果分離時間延長到24天，則可以檢測13075個蛋白。
一篇2014年發表在Nat Method上的文獻報道，採用IEF（等電聚焦電泳，isoelectric focusing）與RPLC結合，樣品是人的上皮癌細胞，上樣量為800μg，分成了360個餾分，耗時超過15天，一共分析到13078個蛋白。
就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！
Tips :
對於分餾分，通常是利用C18的色譜柱來分級分餾分，這個沒有試劑盒。
2. 磺酸基陽離子交換鍵合硅膠色譜柱，怎樣維護保養及活化
首先在開始使用系統以前檢查柱子有否微生物生長，否則柱子會堵塞，柱壓會升高到無法接受的水平。然後，不接檢測器，正向安裝色譜柱，使用純甲醇以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積。
再連接檢測器，用純甲醇以0.6ml/min流速沖洗約20倍柱體積。
然後使用去離子水以0.6ml/min流速沖洗約20倍柱體積。
最好再確保連接好保護柱（多使用相應柱製造商針對性提供的保護柱），再用選用的洗脫液以0.6ml/min流速平衡1h以上，進樣檢測。同樣，若洗脫液中含有緩沖鹽類，在用分析洗脫液平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例洗脫液過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內析出。
特別注意：
①洗脫液要求是新制的緩沖液。對於陽離子交換柱，多用檸檬酸或酒石酸緩沖液（或其混合溶液）、鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5；對於陰離子交換柱，多用磷酸緩沖液、硝酸銨溶液（1mMol/L），鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5。絕對禁止使用水楊酸緩沖液，因水楊酸分解產物會改變固定相的性質。洗脫液在使用以前必須用0.45um濾膜過濾並徹底脫氣，以防止發生檢測和泵送問題。
②提倡在室溫環境使用，為了提高分析的穩定性，可以設置高於室溫5～10℃的柱溫，最好不要在40℃以上使用。
③使用過程中不要超過其耐受最高壓力。
④增加流速或者降低流速要採取小的間隔變化以防止柱床的擾動。更換柱子，必須先降低流量至0，等待洗脫液完全流出柱子，壓力變化到0（約2min）後再更換。
⑤必須防止將來自流動相或者樣品中的疏水性或與流動相極性差別很大的化合物進入色譜柱，特別地，要絕對禁止導入顆粒雜質，以防止操作壓力增高，污染物難以或者不能去除。
（6）分析完畢，凈化程序基本同C18柱，先用去離子水以0.6ml/min流速沖洗約20倍柱體積。然後用甲醇以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積，純甲醇飽和後密封保存即可。（注意：一定要確保在柱子內沒有緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下保存色譜柱。）
（7）長時間保存後重新使用，重復上述（1）～（6）即可。
3. 檢驗陽離子交換柱失效的方法
取交換後的水加入肥皂水。陽離子交換柱是把一定比例的陽離子交換樹脂混合裝填於同一交換裝置中，對流體中的離子進行交換、脫除，檢驗其失效的方法是取交換後的水加入肥皂水，若泡沫少，浮渣多，說明陽離子交換柱已失效。
4. 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液
如果不限定純抄化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交換。
此時就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running
buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。
5. 陽離子交換柱是什麼
陽離子交來換柱把一定源比例的陽離子交換樹脂混合裝填於同一交換裝置中，對流體中的離子進行交換、脫除。
離子交換柱也稱混床 。所謂的離子交換柱，就是把一定比例的陽、陰離子交換樹脂混合裝填於同一交換裝置中，對流體中的離子進行交換、脫除。
離子交換柱（混床）的分類：混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種：
1、體外再生混床適合小流量、對環保有嚴格要求的企業。但由於體外再生式混床配套設備多，操作復雜，現在已很少使用。
2、體內再生混床和陰樹脂外移再生混床適合大流量，有專門的水處理操作人員及廢水處理的場合。體內再生混床在運行及整個再生過程均在混床內進行，再生時樹脂不移出設備以外，且陽、陰樹脂同時再生，因此所需附屬設備少，操作簡便。
3、陰樹脂外移再生混床：陰樹脂外移再生式混合床及其配套的陰樹脂再生柱基本構造與小型逆流再生固定床大致相同，陰樹脂再生柱厚度較混合床小，所需的膨脹高度為樹脂層高度的50%～60%，故再生柱可較低，但一般為統一起見做成與混合床相同。
6. 6M鹽酸胍溶解的變性蛋白吸附不到離子交換柱上
暈，6M
鹽酸胍
，是
強電解質
，
NH2
-
C
=
(NH2+Cl-)
-
NH2
，
怎麼能夠
上
離子交換柱
，建議用尿素溶解
包涵體
，尿素NH2
-
C=0
-
NH2，
非電解質
的
7. 用陽離子交換柱子分離蛋白，怎麼調緩沖液ph
不知你將什麼"緩沖液"調節到一定PH濃度？把問題講明了一點…
8. 蛋白質水解產物陽離子交換柱層析時的洗脫順序
pI 10.76的那個應該帶正電荷。陽離子交換柱本身帶負電荷。
9. 設計一個ph穩定范圍已知的蛋白分離純化實驗，利用那個類型的離子交換柱
如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離內子交換。容
此時就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running
buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。