PEG會不會影響離子交換

① PEG介導的原生質體轉化

此方法首先要獲得去細胞壁的原生質體，可用胞壁降解酶除去芽管或菌絲的細胞壁。通常使用的是酶混合物，例如纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶等，這些胞壁降解酶混合使用通常會更好地發揮去壁作用，在原生質體准備過程中，要求滲透壓穩定劑。1987年Penttila等第一次在里氏木霉（Trichoderma reesei）原生質體制備基礎上利用PEG介導實現木霉的轉化，以後的其他研究者的木霉PEG轉化大多是在他的基礎上進行改良而來，在原生質制備過程中成功使用山梨醇保持滲透壓穩定，濃度為1.2M，MgSO₄可以作為替代品。此外，有些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。T.reesei使用1.0～1.2M的山梨醇可有效控制滲透壓穩定性，後代再生率為90%。經過PEG轉化，原生質體再生率從90%降至12%～35%。PEG轉化技術的主要優勢在於盡管不同物種的原生質體形成和傳代是非常多樣的，但該方法均可適用。一般來說，原生質體儲存越久，轉化效果越差（Penttila et al.，1987b），所以原生質體需要現用現制備。此外，原生質體常常不止一個細胞核，這需要做長時間凈化處理以得到同核體。

PEG介導的原生質體轉化法是通過PEG的介導作用將遺傳因子轉入受體細胞原生質體中的一種方法，原生質體的制備與再生是轉化的關鍵，此外CaCl₂也是不可或缺的成分。目前，多數絲狀真菌的轉化以原生質體作為感受態細胞，在一定濃度的CaCl₂和PEG等條件下和需轉化的外源DNA混合完成的。因此，PEG介導的原生質體轉化法包括原生質體的制備和原生質體轉化兩個主要過程。

8.1.1.1 原生質體的制備與再生

原生質體制備的最大障礙就是細胞壁，木黴菌細胞壁的主要成分為多糖，其次為蛋白質、類脂。多糖主要有幾丁質、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等。因此，目前主要通過使用纖維素酶、蝸牛酶或溶壁酶等酶法去除細胞壁。具體採用的酶種類、濃度等需要通過具體的實驗來確定。影響原生質體制備的因素很多，不同的木霉有其較為適當的形成條件。主要考慮的因素有：①菌齡的選擇。菌絲的菌齡對原生質體的產量影響很大，不同菌齡的菌絲在同樣的條件下酶解所得到的結果不同，利用合適菌齡的菌絲所得的原生質體明顯較多，這與許多黴菌的原生質體分離的情況相似，菌齡過長，菌絲細胞壁發生老化增厚，不易於釋放原生質體，菌齡過短則菌絲體易破裂，釋放原生質體數量較少，因此，需要針對不同的菌株生長發育情況具體確定合適的菌齡。②破壁酶系統的選擇。適當的破壁酶組合是成功地釋放原生質體的關鍵。由於真菌的細胞壁組成復雜，使用單一酶類處理一般效果不理想，所以，通常會採用多個酶的組合配製成復合酶液，並確定相應的酶解時間和酶解溫度等相關條件。③滲透壓穩定劑對原生質體釋放的影響。形成原生質體後，細胞膜失去細胞壁的保護，容易破損，不易保存，而滲透壓穩定劑可以維持原生質體細胞膜內外壓力恆定和原生質體形狀，使原生質體不易破裂且有助於後續試驗的進行。因此，滲透壓穩定劑是影響原生質體產量的關鍵因素之一。常用的滲透壓穩定劑有山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、MgCl₂、KCl、NaCl等，例如Penttila等（1987b）在制備T.reesei原生質體時使用山梨醇保持滲透壓穩定，濃度為1.2M，濃度為1.2M的MgSO₄也可作為替代的材料。此外，針對某些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。針對木霉的原生質體制備有選用無機鹽的，例如田媛等（2010）制備康寧木霉（T.koningii）原生質體時發現無機鹽溶液有利於原生質體的釋放，而糖醇類不利於原生質體釋放。原因可能是無機鹽能夠促進酶的活性，使酶與細胞能夠充分接觸。滲透壓緩沖液中NaCl最好，KCl次之。而趙樂輝等（2005）在制備木霉T21和T22原生質體時發現蔗糖和甘露醇最合適，所以具體選用什麼試劑作為制備原生質體的滲透壓穩定劑還需根據具體情況來定奪。

原生質體的再生是進行轉化後篩選的關鍵步驟，每個再生後的原生質體可以成為一個無性生殖體，影響再生的因素很多，主要有：①酶濃度和酶解時間。酶濃度對原生質體再生影響很大，由於使用的破壁酶多數為復合酶，其中會含有對原生質體有害的酶類（例如過氧化物酶、核糖核酸酶等），這些酶必然會影響原生質體的活性。過高的酶濃度使細胞破壁太徹底導致原生質體的細胞膜破裂，使再生率降低。酶解時間對原生質體產量和再生有雙重影響。酶解時間短，對原生質體活性影響較小，因而有利於再生，但是原生質體的產量相對低；而延長酶解時間，雖然可以提高原生質體產量，但對原生質體活性影響較大，因而原生質體的再生率明顯降低。所以，酶解時間的選定要統籌考慮原生質體的產出率和再生率。②滲透壓穩定劑的影響。有些無機鹽有利於原生質體的產出，但再生時可能在平板周圍形成高鹽環境而不利於菌落的形成，而使用糖醇類的滲透壓穩定劑由於其對原生質體具有保護作用，還可作為營養利於菌絲生長，所以可能比無機鹽更有效。③不同再生培養基對原生質體再生有顯著影響。例如黃玉茜等（2005）發現，將制備好的木黴菌T23原生質體分別在基礎培養基、完全培養基、改良查氏培養基上再生，結果表明，在基礎培養基上再生率最高，平均達到25.4%，其次為完全培養基，再生率平均為21.3%，改良查氏培養基的再生效果最差。

再生率＝（高滲溶液稀釋所長出的菌落數-用無菌水長出的菌落數）/加入原生質體數×100%

在液體再生培養基中可以觀察到原生質體的再生方式，木霉的原生質體通常會在滲透壓穩定劑的作用下，液泡吸水而膨大，在體內形成一個或多個大液泡，並向一端伸展，失去圓球形狀，並形成不規則的突起，不規則的突起然後類似出芽狀長出念珠狀畸形萌發管，最後發育成正常菌絲。

8.1.1.2 原生質體轉化

原生質體與外源DNA在包含CaC1₂的PEG緩沖液中混合，最後將原生質體塗布於再生培養基中選擇轉化子。其主要原理是PEG能使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使細胞接觸和粘連；或是通過引起表面電荷紊亂，干擾細胞間的識別，而有利於細胞間的融合或外源DNA的進入。一般認為，PEG與細胞膜內的水、蛋白質和糖類分子形成氫鍵，使得原生質體連在一起而發生凝聚，並由於Ca²⁺的存在而加強，這種細胞間凝聚能夠促進DNA的吸收。PEG濃度過高或作用時間過長，易於使原生質脫水破裂，失去再生活性，從而使轉化率下降。

為了篩選轉化子，轉化載體一般需要攜帶抗性標記基因，按基因編碼產物的功能可將這些選擇標記分為三大類，即營養缺陷型標記、葯物抗性標記和功能產物標記：

（1）營養缺陷型標記：包括一些碳源、氮源和硫源的代謝基因，它們能與相應的營養缺陷型絲狀真菌受體菌遺傳互補，從而通過營養缺陷篩選出目標轉化子，常見的營養缺陷篩選有編碼精氨酸生物合成途徑中鳥氨酸氨甲酞轉移酶的argB⁺基因和編碼尿嘧啶生物合成途徑中的乳清苷-5』-磷酸脫羧酶的Pyr4⁺基因。

（2）葯物抗性標記：目前常用的葯物抗性標記有編碼苯菌靈抗性的bml基因，編碼寡黴素抗性的oliC基因；還有來自細菌的潮黴素抗性基因（hygB）、苯並咪唑類殺菌劑抗性基因 Ben^R、博來黴素抗性基因（Zeo^R）、G418 抗性基因（Neo^R）、抗硫胺素基因（ptrA）、腐草黴素抗性基因及氨基糖苷類，大環內酯類，金屬糖肽類抗生素抗性基因等，其中，潮黴素抗性基因的應用最為廣泛。

（3）功能標記：構巢麴黴（Aspergillus nilans）amds基因編碼乙酞胺酶，而黑麴黴菌及許多其他的絲狀真菌不能合成此酶，因此，將這些絲狀真菌塗布在以乙酞胺為唯一碳源或氮源的選擇性培養基上，即可方便地篩選攜帶amds型質粒的轉化子。1995年Thrane等通過PEG介導的原生質體轉化方法將來源於大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因轉入哈茨木霉（T.harzianum）T3中，木黴菌轉化子也可在x-gal平板上呈現藍色反應或在熒光顯微鏡下分生孢子梗和分生孢子被觀察到綠色熒光的存在，可用於木黴菌的在植物上定殖和在土壤等環境中的分析檢測研究。

大多數絲狀真菌的轉化載體在宿主菌中不能自主復制，而是同源或者異源整合到宿主菌的基因組中。重組效率依賴於多種因素，包括轉化的方法和條件、轉化的宿主菌、轉化的DNA片段與宿主基因組的同源程度及同源序列的長度等。營養缺陷型標記有可能引導載體質粒整合染色體的同源部位，易於篩選，但作為受體的營養缺陷型的篩選比較困難，特別是對一些工業生產菌、病原菌和多倍體菌株幾乎難以實現，而葯物抗性標記和功能標記則避免了前者的缺點，但帶來的環境生物安全問題值得探討。即使不存在任何選擇性壓力，轉化子在有絲分裂過程中會表現出高度的不穩定性，抗葯性篩選容易出現陽性假轉化子現象。大多數的絲狀真菌轉化實驗都證明了這一點，尤其對粗糙脈袍菌的轉化實驗。轉化子DNA丟失不穩定的原因可能有部分重復DNA的甲基化、DNA的被切割和DNA重排等。下面提供一種本實驗室常用轉化木霉方法，僅供參考，具體步驟如下：

（1）原生質制備：取1mL木霉分生孢子懸浮液（1×10⁸孢子/mL）接種到PD中，28℃下振盪培養20h。用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，無菌水沖洗5次，0.16M KCl沖洗至菌絲半透明。向菌絲中加入2mL濃度為10mg/mL的溶菌酶，混勻，30℃下放置3h後用4層紗布過濾，0.6M KCl沖洗。濾液在5000r/min下離心15min。獲得的原生質體用STC［原生質體保存培養基，0.6M蔗糖、10mmTris-HCl（pH8.0）、10mmCaCl₂］沖洗兩遍，懸浮於STC中在4℃下保存。

（2）原生質體再生：先在培養皿底部鋪上一薄層OcmBOTTOM培養基（1mol/L蔗糖的CM培養基；OcmTOP培養基：OCM中加入1%瓊脂；OcmBottom培養基：OCM中加入1.5%瓊脂），再將原生質體與冷卻至40～45℃的再生培養基輕輕混合，倒入上述平板，黑暗培養4～5d，計再生菌落數。原生質體再生率計算：

原生質體再生率＝再生培養基上生長的菌落數（個）∕塗布原生質體數量（個）×100%

（3）原生質體轉化：將准備好的質粒5μg加入含有200μL原生質體的50mL離心管中混合均勻，室溫下靜置20min；加入1mL40%PTC［原生質體再生培養基，1×STC中含40%（W/V）PEG8000］，0.22μm細菌過濾器過濾除菌到管中，輕輕混勻，室溫下靜置20min；加入5mL TB3（含50μg/mL 氨苄青黴素），室溫、175r/min下搖床培養過夜。

（4）原生質體篩選：將培養過夜的原生質體在3500r/min下離心10min，棄上清液，用剩餘大約5mL的殘液懸浮沉澱；融化Bottom Agar培養基並冷卻到65℃，轉移10mL Bottom Agar培養基到含有已復生原生質體的50mL離心管中，加入氨苄青黴素到終濃度50μg/mL，混勻後快速倒入平板；25℃培養10h後，再倒上含有較高濃度潮黴素的Top Agar篩選培養基，25℃下培養2～3d後，挑取平板上的單個菌落，轉接含有無抗培養基上培養傳代，並經過PCR鑒定和southern blot鑒定確定轉化子。

② PEG的理化性質

化學結構由環氧乙烷聚合而成。液體PEG採用200Kg鍍鋅桶包裝；膏狀PEG採用50Kg廣口桶包裝；固體PEG採用25Kg塑料襯里紙板桶或編織袋包裝。該品無毒、難燃，可按一般化學品運輸規定辦理，貯存於乾燥、通風處，避免陽光照射和雨淋。
聚乙二醇（PEG），也稱為聚(環氧乙烷)（PEO）或聚氧乙烯（POE），是指環氧乙烷的寡聚物或聚合物。這三個名稱現今一般為同義詞，但歷史上聚乙二醇往往是指分子質量低於20,000 g/mol的低聚物和聚合物，PEO是指分子量超過20,000的聚合物，POE則可指任何分子質量的聚合物。PEO以及POE根據分子量的不同，可為液體或低熔點液體。由於鏈長的影響，不同分子量的聚乙二醇往往有不同的物理性質（如黏度）及不同的應用，但大部分的聚乙二醇化學性質是相似的。低分子量的聚乙二醇通常指較純的寡聚體，較具單分散性 ；高純度的聚乙二醇具有結晶性，因此可用X-光決定其晶體結構。由於純化和分離寡聚體聚乙二醇較為困難，因此價格通常是多分散聚乙二醇的10-1000倍。
聚乙二醇溶於水、甲醇、苯、二氯甲烷，不溶於乙醚和正己烷。它與疏水性分子結合後的產物可用作非離子表面活性劑。聚乙二醇可以用於修飾葯物蛋白，以保護葯物分子延長其作用半衰期。

③ 影響PEG融合的因素

答：1. PEG的分子量與濃度: 細胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高, 對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實驗時常常採用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。2. PEG的pH值: 經驗證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3. PEG的處理時間: 處理時間越長，融合效果越好, 但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鍾之內。本實驗中細胞融合後無需繼續培養, 故處理時間可適當放寬至數分鍾。4. 融合時的溫度: 由於生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果, 在細胞可能承受的溫度范圍內可適當提高處理的溫度。對於哺乳動物的細, 一般採用的溫度為38~40℃。