離子交換層析法分離血清免疫球蛋白

1. 求分離，純化,鑒定γ球蛋白的具體方法（包括原理，步驟，預期結果，注意事項）謝謝

[原理]

血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約佔16％，100ml血清中約含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉澱分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉澱析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離,沉澱部分即為含有γ-球蛋白的粗製品。

用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗採用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG--25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而後洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。

脫鹽後的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的α－球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的γ－球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ－球蛋白，從而使γ－球蛋白粗製品被純化。其反應式如下：

用上述方法分離得到γ－球蛋白是否純凈，單一？可將純化前後的γ－球蛋白進行電泳比較而鑒定之。

[操作]

(1)鹽析――中性鹽沉澱：取正常人血清2.0ml於小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻後於室溫中放置10min，3000r／min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，於沉澱中加入0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即為粗提的γ－球蛋白溶液。

(2)脫鹽――凝膠柱層析

①裝柱

洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。

②上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。

加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉澱即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑應用液l滴，以觀察NH4+出現的情況。

合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。

(3)純化――DEAE纖維素陰離子交換層析：用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。

(4)濃縮――經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。

(5)鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳 取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽後的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點上。然後參閱實驗二十四：乙酸纖維薄膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。

[注意事項]

(1)凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。

(2)裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

(3)本法是利用γ-球蛋白的等電點與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。

(4)電泳注意事項見實驗二十四。

(5)凝膠貯存：凝膠使用後如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉。保存於4℃冰箱內。若長期不用，應脫水乾燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干後，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最後一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然後用多孔漏斗抽干後，於60～80℃烘乾貯存。

(6)離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用後只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、鹼處理，最後用水洗至接近中性。陽離子交換劑最後為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為鹼一水一酸一水。由於上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強鹼長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3-4h。

離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。

除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然後倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結紮好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出後，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，並在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。

濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用後(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10℃以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG一25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。

[試劑]

(1)飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g，置於1000ml蒸餾水中，在70一80℃水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。

(2)葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠 25g。稱取所需量置於錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30ml，用玻璃棒輕輕混勻，置於90～100℃水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h後取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可於室溫中浸泡24h，攪拌後稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2～3次，然後加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE纖維素14g稱取，每克加0.5mol／L鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉後，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌後放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然後加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(4)0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)

A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)2.730g溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。

B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至 1000mL。

取A液77.5ml，加於B液22.5ml，混勻後即成。

(5)20%磺基水楊酸溶液

(6)奈氏(Nessler)試劑應用液

①貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58於250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振搖10min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉澱，洗滌液一並倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100ml。

②應用液：取貯存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

(7)0.9％氯化鈉溶液

(8)乙酸纖維素薄膜電泳有關試劑(見實驗二十四)

(四)親和層析

生物體中許多高分子化合物之間具有專—性可逆結合的特徵，例如：酶蛋白和輔酶，抗原和抗體，激素與受體，核糖核酸與互補的脫氧核糖核酸等。生物分子間的這種專一性結合能力稱為親和力，根據生物分子間親和力大小產生吸附和解吸作用而建立的層析方法稱為親和層析。

親和層析的基本過程如下：具有親和力的一對分子，其中一種分子作為配基，固定化結合在不溶性載體上裝入層析柱成親和柱，當含有另—種分子的混合液作為流動相流入親和柱時，能與配基親和結合的分子被吸附，其它雜質直接流出，再改變流動相的溶液，使配基與其親和物解離從而解吸出待分離的分子來。

親和層析中最常用的具有親和力的生物體系有：

酶：底物、抑制劑、輔酶

抗體：抗原、病毒、細胞

外源凝集素：受體、載體蛋白

細胞：細胞表面特異蛋白，外源性凝集素

2. 五類免疫球蛋白分離純化的方法有何不同

一般選用2～3種，或同一方法反復進行2～3次。

鹽析法：在不同濃度的中性鹽中蛋白質會脫水，降低帶電電勢，親水性變為疏水性，分子間相互凝聚而沉澱（鹽析作用）。不同蛋白質鹽析所需中性鹽的濃度不同，故可分離不同蛋白質。常用中性鹽：硫酸銨分析純試劑。

離子交換層析法：利用不同的蛋白質在緩沖溶液中所帶電荷不同，與某一載體上的具有相反電荷的離子基團進行吸附，然後進行解脫，達到純化蛋白質目的。常用載體：纖維素DEAE，帶正電，吸附帶負電的Alb、α、β球蛋白。

凝膠過濾法：凝膠顆粒是網狀結構，當分子大小不同的混合物通過凝膠柱時，分子大的先下來，分子小的嵌入凝膠顆粒的網狀結構中後下來，從而將分子大小不同的物質分離開來，即為分子篩的作用。常用凝膠：葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂糖凝膠，分離Ig多用G150。

親和層析法：利用抗原抗體的結合具有特異性、可逆性，將純化抗原先交聯到載體（瓊脂糖珠）上，製成親和層析柱，當Ab（Ig）通過時，與抗原特異性結合在柱上，Ab中雜質流出。然後通過改變緩沖液 pH、離子強度，使Ab解脫下來。

3. 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性

1，離子交換樹脂固定床的床層壓力會隨著分離過程的進程而不斷加大，需要重回新填充答。同時，也造成固定床填充過程操作麻煩，而且密封性要求高。2，蛋白質分離純度問題，如果在出峰之後再行切換接收餾分，而在峰行下降後提前切換，雖可以保證純度，但蛋白分離收率則會下降。3，由於交換層析介質決定，不同蛋白質相互分離效果也不確定，這種分離，也易造成各蛋白峰重疊，造成分離純度下降。4，自動化程度不高。主要也是受固定床以及樹脂交換飽和當量無法保持長期穩定造成的。無法像液相色譜柱那樣，可以在標樣標定後，建立方法，自動分離目標蛋白。5，不過，規模化分離純化蛋白質過程，使用這種層析法，還是具有一定優勢的。
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詳細資料請參考：
離子交換層析: http://proct.bio1000.com/100474/

4. 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。
2.根據溶解度不同進行分離純化

影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。

5. 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用版離子交換柱層析法分離不同的權蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。

6. 蛋白質分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(6)離子交換層析法分離血清免疫球蛋白擴展閱讀：

蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。

機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。

人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。

7. 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性

1. 因為抄離子交換吸附蛋白質並不是特異性吸附，在某些情況下可能難以判斷結合的蛋白質是否為當初設計的目的蛋白。

2. 離子交換吸附依賴於蛋白質表面的靜電荷，如果蛋白質結構比較特殊，可能會有在各種pH都難以結合上離子交換層析的情況。

3. 離子交換層析對於等電點與目標蛋白接近的雜蛋白並沒有很好的分離效果。

8. 免疫球蛋白提取實驗注意事項及原因

IgG的分離與提純

（一）材料與試劑配製
1．動物血清
2．硫酸銨飽和溶液
硫酸銨 800g~850g
H2O 1 000ml
加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然後以28％NH4OH調pH至7.0（不調pH值也可以）。
註：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過夜後濾過，加熱蒸發H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化後過濾，然後再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃紙）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合後，靜置30min。
2．3 000r/min離心20min，棄去沉澱，以除去纖維蛋白。
3．在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
4．3 000r/min離心20min，棄上清。
5．於沉澱中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合後，靜置30min。
6． 3 000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。
7． 用10ml生理鹽水溶解沉澱，裝入透析袋。
8． 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中於4℃透析24h，中間換液數次。
以1％BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4+（取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現磚紅色即認為有NH4+存在），直至無 SO42-或NH4+出現為止。也可採用SephadexG25或電透析除鹽。
9． 離心去沉澱（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉澱血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．過DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。
也可採用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白質及其定量鑒定（見本章第八節）。
12．IgG的純度鑒定 可採用下列方法之一鑒定。
⑴ 區帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳後，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
⑵ 瓊脂雙相雙擴散鑒定：預先准備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉澱線。
⑶ 免疫電泳鑒定：（操作見第三章免疫電泳部分）。孔內加待測樣品，電泳後，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉澱線，且沉澱線位於γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
⑷ 圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。
13．IgG的濃縮與保存
⑴ IgG的濃縮：參看本章第九節。
⑵ IgG的保存：一般濃縮至1％以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。
（三）IgG的簡易快速提取法
應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往採取下列的簡易辦法。
1． DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。
⑴ 以一定數量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。
⑵用布氏漏斗（內放兩層濾紙）過濾。
⑶以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。
⑷於4℃中放置1h，中間攪拌數次。
⑸用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50為弱鹼性陰離子交換劑，經NaOH將Cl-型轉變為OH-型後，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G屬中性蛋白外其餘均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ－G。這種提取法流程大大縮短，純化前後樣品體積變化不大，而且所得γ－G無變性現象。經過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE－SephadexA－50若干克，懸浮於蒸餾水中，1h後傾去上層小顆粒，然後用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，最後以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾乾的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。
⑶ 再用同樣重量的DEAE－SephadexA－50處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ－G製品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）後，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。

9. 為什麼說離子交換色譜法是分離蛋白質的最佳方法

它是根據蛋白質的組成物質氨基酸的物理性質（基於氨基酸電荷行為）為分離基礎的方法。相對透析和超過濾及凝膠過濾來說，可以針對多種蛋白質中的某一種（前提是知道蛋白質的氨基酸組成及其離子交換樹脂的親和度及洗脫強度）進行分離。（而透析和超過濾還有凝膠過濾方法更大的取決於相對分子質量及其結構 分離出的單一蛋白質純度相對要低 並且凝膠過濾要求凝膠對要求組分不能有吸附作用 適用性較低 ） 相對鹽溶和鹽析來說，分離單一蛋白質的純度要高，且更好的保留其天然理化性（鹽溶要求蛋白質分子吸附某一鹽離子從而改變其溶解性 但有些蛋白質吸附某些鹽離子後其蛋白質構象及理化性會發生改變）。 相對有機溶劑分級分離法，更好的保留其天然理化性（有機溶劑分類法易造成蛋白質不可逆變形 且適用范圍窄） 相對凝膠電泳和等電聚焦來說 更易於實現大量制備分離 且不改變蛋白質結構和功能（電泳會影響蛋白質結構 且操作繁瑣 成本高） 相對親和層析來說 它更加易於實現且成本低廉效果也不錯（親和層析需要制備其配體並與載體交聯 因而制備難且成本較高）
PS: 最好的分離方法不是例子交換色譜法 而是高效液相色譜法 相對離子交換色譜來說有著更高的效率、更高的解析度和過柱速度