離子交換buffer

① 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液

如果不限定純抄化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交換。
此時就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running
buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

② 關於蛋白質分離的問題

先通過sepharose G50將分子量為41kD與小分子量的蛋白分開。然後用離子交換膠如DEAE，buffer pH7.0，分離兩種41kD的蛋白。小分子的兩種蛋白通過HPLC分離。

③ 起始緩沖液和終止緩沖液是什麼意思staring buffer / final buffer 離子交換色譜中提到此點。希望大家解

像這種用於純化蛋白的實驗方法中一般都會有這個。starting buffer 就是適合柱子最適的版buffer，比如鹽濃度，pH等。final buffer 是將目的蛋權白洗脫用的buffer，一般是某一個鹽的含量提高。

④ 背板交換容量和背板帶寬的區別

一、從定義上看背板帶寬和交換容量的差異：1、背板帶寬：交換機數據匯流排的與交換機介面卡(或介面處理器)之間處理數據量的最大值，被稱為背板帶寬。背板帶寬的值越大，代表交換機的數據交換能力越強。2、交換容量：交換容量是指交換機中的離子交換劑所能產生的交換離子量的大小，交換機的交換容量受到很多因素的影響，最大的影響因素就是離子交換劑的大小。二、從計算方式上看背板帶寬和交換容量的差異：1、背板帶寬：背板帶寬=2×埠數×相應埠速率2、交換容量：交換容量=(NaOH標准溶液的濃度×NaOH標准溶液的用量)/樣品濕重×固體含量【計算】一台交換機背板帶寬需要多大?一台交換機的背板帶寬越大，交換機的性能越高，處理數據的能力越強，但是成本也會增加。所以要選擇合適的背板帶寬，避免造成浪費。如果計算一台交換機的背板帶寬多大合適，需要從下面兩個方面來考慮：考慮一：通過計算的方式，2×埠數×相埠容量所得的值小於背板帶寬，這樣就能保障交換機發揮最大的性能，同時又不造成浪費。考慮二：要考慮交換機的吞吐量，在包長64位元組時，交換機的1個千兆埠的吞吐量是1.488Mpps(理論值)，10個千兆埠的吞吐量就是14.88Mpps。在以上兩個方面都滿足的交換機背板帶寬才是最合適的。背板帶寬、吞吐量都要考慮情況，在選擇的時候要結合考慮，不要單考慮一方面。背板帶寬資源的利用率與交換機的內部結構息息相關!一台交換機的內部結構分為三種：一種是共性內存結構，這種共性內存結構對於內存帶寬的需求量非常大;第二種是交叉匯流排結構，交叉匯流排機構的單點傳輸要比多點傳輸性能好的多，所以交叉匯流排結構多運用於單點傳輸上面;還有一種是混合交叉匯流排結構，混合交叉匯流排結構降低了匯流排數，避免了浪費，所以節省了很多成本。

⑤ 如果一個蛋白質只是在PH6-6.5范圍內穩定，請設計一個通過離子交換層析純化該蛋白質的實驗

你是不是說混淆了，到底是等電點在pH6-6.5？還是等電點未知，確在6-6.5穩定？
我就先按等電點來理解，回答你的問題。
如果對蛋白純化的濃度要求不高，或者待純化樣品成分簡單，雜蛋白少，就選一種離子交換層析，即陽離子離子交換層析（running buffer 設pH5.0比較合適）或陰離子交換層析（running buffer 設pH7.5比較合適）。
如果雜蛋白多，就用兩步離子交換層析，即結合陰陽離子交換層析。一般建議先做陽離子交換層析（這樣第一步可去掉核酸之類的）。不知你要多具體的步驟，先寫個大致步驟吧：
1，陽離子交換層析：將你的樣品置換到pH5.0的running buffer（一般醋酸鈉buffer）。同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（升pH或鹽洗脫），收峰。這步就去掉等電點在6之下的大部分雜蛋白；
2，陰離子交換層析：將所收蛋白置換buffer至pH7.5的running buffer（PB），同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（降pH或鹽洗脫），收峰。去掉pH6.5之上的大部分雜蛋白。
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如果你確實所指在6-6.5穩定，那就看你蛋白的等電點在多少了，只好選一種離子交換層析，在6.5之上就試試pH6.0的running buffer做陽離子交換層析，在6.0之下，就試試pH6.5的running buffer做陰離子交換層析。
若有疑問，歡迎繼續討論，純屬手打，歡迎採納，祝新年愉快！

⑥ 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液

如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交內換。
此時就容要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

⑦ 樣本前處理（三）

蛋白提取的質量控制

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

脫鹽

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

Tips :

樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對樣品造成影響，我們提取蛋白時使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話，造成樣品體積太大，下一步加入酶後，則酶和蛋白的濃度會特別低，酶解效果受到很大影響。另外，體積太大處理起來也不方便。這時也可以使用超濾的方法，多步稀釋，將尿素的濃度降到1M以下。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

還原烷基化及酶解

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

Tips :

如果做iTRAQ（或TMT）標記，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系。因為iTRAQ（或TMT）試劑是標記末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會被標記上，影響蛋白的標記效率。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

蛋白質及肽段的預分級

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

Tips :

通常，我們通過RPLC與質譜聯用。因為RPLC體系是用水和乙腈，易揮發，不含鹽，可以直接送入質譜進行檢測。而像SCX/SAX這類正相柱，需要通過高鹽的體系將樣品洗脫下來，所以它與質譜不兼容。我們在做多級分離時，前面都會有各種鹽的洗脫，最後才是RPLC，然後就可以直接連質譜了。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

一篇2013年發表在MCP上的文獻報道，採用RP-RPLC兩級分離，分成常規的24個餾分，上樣量為100μg，在一天內能檢測到8000多個蛋白。

一篇2013年發表在Nat Comm上的文獻報道，先採用RP柱分級，再使用SAX分離，然後通過1米的長柱子反相色譜分離。樣品為人的胚胎幹細胞，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測了9818個蛋白，如果分離時間延長到24天，則可以檢測13075個蛋白。

一篇2014年發表在Nat Method上的文獻報道，採用IEF（等電聚焦電泳，isoelectric focusing）與RPLC結合，樣品是人的上皮癌細胞，上樣量為800μg，分成了360個餾分，耗時超過15天，一共分析到13078個蛋白。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

Tips :

對於分餾分，通常是利用C18的色譜柱來分級分餾分，這個沒有試劑盒。

⑧ 用於蛋白質提取分離的離子交換劑有哪些特殊的要求,主要有哪幾類

離子交換層析根抄據帶電強弱分為：強陽離子交換層析、強陰離子交換層析、弱陽離子交換層析、弱陰離子交換層析。填料的孔徑也有分別，詳細可以咨詢各品牌代理商。

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⑨ 有四種蛋白質溶液，其大小和等電點分別是54kD和4，48kD和7，100kD和4，75kD和10 ，請設計實驗

（1）100kD蛋白的純化可以分為兩步：離子交換和分子篩。因為48kD和75kD的蛋白等電點與目的蛋白相差很大，所以在相同的buffer條件下，前兩者帶點性質與目的蛋白相差很大，通過離子交換的方法可以將三者分開。具體來說可以選用pH5.5左右的buffer，用Q柱純化。54kD的蛋白和100kD的蛋白電荷性質類似，通過離子交換層析可能分不開，但二者分子量有近兩倍的差距，適用於分子篩，所以第二步選用合適的分子篩利用二者分子量的大小分開即可。

（2）6M鹽酸胍處理之後除了肽鍵和二硫鍵無法打開之外，蛋白完全變性。這種條件下測得的分子量是25kD，加入beta-ME之後二硫鍵被還原打開，測得分子量為10kD和15kD，說明這二者是通過二硫鍵相連的，所以結構為一個10kD和一個15kD的亞基通過分子間二硫鍵的作用連成二聚體。也有可能是異源四聚體，異源六聚體，異源八聚體等等。因為第一步測定的分子量是在鹽酸胍條件下，多聚體之間如果沒有二硫鍵連接也會被解聚。如下圖：

⑩ 交換容量與背板帶寬的區別

背板帶寬：表示的是我們的介面處理器或者介面卡和核心交換引擎之間的速度，大家可能都知道我們計算一個交換機要達到線速轉發的一個背板帶寬的標準是》=2*埠數量*埠帶寬哈，大家也看得到現在的交換機標稱的背板帶寬都大於我們的那個理論值，但是交換機的線速轉發的實際情況並不一定是這樣，那是因為他還不是最核心的參數。交換機背板是設計值，可以大於等於交換容量（此為達到線速交換機的一個標准）。廠家在設計的時候考慮了將來模塊的升級，比如模塊從開始的百兆升級到支持千兆、萬兆，埠密度增加等。背板帶寬一般是指模塊化交換機。它決定了各模板與交換引擎間的連接帶寬的最高上限。是交換機介面處理器或介面卡和數據匯流排間所能吞吐的最大數據量。背板帶寬標志了交換機總的數據交換能力，單位為Gbps，也叫交換帶寬。
交換容量：表示的是我們的交換機的核心的交換引擎的轉發速率一般單位用bps來表示哈，他是和緩存（BUFFER）的位寬及其匯流排頻率有關，例如一台交換機的緩存為96而匯流排頻率為133，那麼他的交換容量為96*133=12......，其實現在設備廠家的部分工程師已經認為背板帶寬這個概念沒有意義了，而交換容量和下面要說的轉發率才決定交換機的性能，而這個參數很大程度上取決於交換機矩陣。交換容量（最大轉發帶寬、吞吐量）是指系統中用戶介面之間交換數據的最大能力，用戶數據的交換是由交換矩陣實現的。交換機達到線速時，交換容量等於埠數×相應埠速率×2（全雙工模式）。
包轉發率：其實這個包轉發率說的是三層的包轉發率，上面的交換容量說的是二層的包轉發率。三層包轉發率的計算，簡單說一下，千兆的埠轉發率是多少呢？1000，000，000bps*8*(64+8+12)=1.488M，8表示8個bit，而64+12+8表示的是一個數據欄位為64位元組的幀，在網路上傳輸時候實際所使用的位元組數哈，8位元組的頭部以及12位元組的其他開銷。同理，百兆介面的包轉發率是0.1488M哈。所以，要在三層實現我們的包線速轉發的話至少要滿足這個條件我們的包轉發率。包轉發率它體現了交換引擎的轉發性能。標準的乙太網幀尺寸在64位元組到1518位元組之間，在衡量交換機包轉發能力時應當採用最小尺寸的包進行評價。指基於64位元組分組，在單位時間內交換機轉發的數據總數。