能不能在超濾柱進行酶切

1. 質粒抽提原理

實驗原理
提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為鹼裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優缺點，根據不同的實驗目的可以採用合適的提取方法。詳細內容請參考《分子克隆實驗指南》。另外，復旦大學生化與分子生物學實驗室一篇文章，提供了質粒提取機理的詳細解說。[1]

鹼裂解法

人們使用鹼與SDS裂解法從E. coli（大腸桿菌）中分離制備質粒DNA已有30多年的歷史。將細菌懸浮液暴露於高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。

盡管鹼性溶劑使鹼基配對完全破壞，閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，後者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時，復合物會從溶液中有效地沉澱下來，離心除去變性劑後，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。

在SDS存在的條件下，鹼水解是一項非常靈活的技術，它對E. coli的所有菌株都適用，並且其細菌培養物的體積可以從1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是將細菌懸浮於含有Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然後加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細菌外壁，還有助於解開DNA鏈的鹼基配對，並使蛋白質和染色體DNA變性。但是。閉環質粒DNA鏈彼此不會分離，這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構。當溫度下降後，閉環DNA的鹼基又各就各位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體DNA和蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。煮沸裂解法對於小於15kb的小質粒很有效，可用於提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質粒，並且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。但對於那些經變性劑、溶菌酶及加熱處理後能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用該法。這是因為碳水化合物很難除去，會抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙錠梯度離心中會使超螺旋質粒DNA帶變得模糊不清。大腸桿菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能產生大量的碳水化合物，不適於用煮沸法裂解。

質粒小提試劑盒

用於大腸桿菌中質粒DNA的小量提取，它結合了優化的鹼裂解法，以及方便快捷的硅膜離心技術，具有高效，快捷的特點，能在30min內完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質量的質粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此質粒DNA可直接用於DNA序列分析，各種酶促反應，PCR以及部分細胞系的轉染等。

質粒抽提
質粒抽提

原理
其中用到三種溶液以及硅酸纖維膜（超濾柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ

葡萄糖是使懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價金屬離子從而達到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。

溶液Ⅱ

此步為鹼處理。其中NaOH主要是為了溶解細胞，釋放DNA，因為在強鹼性的情況下，細胞膜發生了從雙層膜結構向微囊結構的變化。SDS與NaOH聯用，其目的是為了增強NaOH的強鹼性，同時SDS作為陰離子表面活性劑破壞脂雙層膜。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷也會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA會斷裂。

溶液Ⅲ

溶液III的作用是沉澱蛋白和中和反應。其中醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的鈉離子而形成了PDS，因為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同時一個SDS分子平均結合兩個氨基酸，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了。2 M的醋酸是為了中和NaOH。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉澱了，所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；同時溶液III的強酸性也是為了使DNA更好地結合在硅酸纖維膜上

質粒抽提步驟
Ⅰ.使用質粒提取試劑盒提取質粒時請參考具體試劑盒的操作說明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin（質粒提取盒）。

Ⅱ.鹼裂解手提法：此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1：接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2mlLB培養基。

2：37℃振盪培養過夜。

3：取1.5ml菌體於Ep管(離心管)，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4：加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。

5：加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），輕輕翻轉混勻，置於冰浴5min.

6：加入0.15m1預冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），輕輕翻轉混勻，置於冰浴5min.

7：以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管

8：加入等體積的異戊醇，混勻後靜置10min.

9：以10，000rpm離心20min，棄上清。

10：用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11：待沉澱乾燥後，溶於50ulTE緩沖液中（或60℃溫育去離子水）

抽提竅門
1：加溶液II（裂解液）後，操作一定要溫和，劇烈混合會導致基因組DNA污染。

2：洗脫時60℃溫育（Ellution Buffer）洗脫緩沖液或去離子水效果更好。

3：若質粒提取含量低，可增加菌液樣或換用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培養基質粒得量高

4：菌體應徹底懸浮 ， 如果沒有徹底懸浮菌體，則殘留的菌體團塊在溶液 II 加入後，變成難以完全裂解的團塊。這個團塊在溶液 III 加入後，會有一部分蛋白質繼續存在於溶液中，成為蛋白質殘留的最大根源。

5：加入溶液 II 後，混勻，體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了，馬上加入溶液 III 中和。

6：中和的操作 ，在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 後，先顛倒兩次，使管底朝上，用指頭彈擊管底數次，再顛倒混勻。效果非常好。

注意事項
降低RNA殘留的方法

RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質粒，都可以降低 RNA 殘留，但都不能徹底去除。幸運的是，RNA 的殘留並不影響酶切等最常用的用途。如果想徹底去除 RNA 殘留，可以用試劑盒，或者使用對 4 個鹼基都作用的 RNase。

降低gDNA殘留的方法

gDNA 的殘留問題，必須在抽提過程中解決，否則，就只能用膠回收方法處理了。gDNA 越大，越難於復性，也就越容易被去除；所以，一定要盡可能不打斷 gDNA。裂解體系越粘稠，gDNA 越容易被扯斷；操作手法越重，gDNA 也越容易被打斷。溫和操作，使用相對過剩的試劑，是降低 gDNA 殘留的最好方法。

降低蛋白質殘留的方法

蛋白質的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質復合物的形成。雖然將中和後的體系置於 4C 一段時間，可以形成更多的該不溶復合物，從而使蛋白質殘留更少，但實踐證明這樣做並不是必須的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 後的懸浮，加入溶液 II 後的裂解及加入溶液 III 後的中和是均勻徹底的，蛋白質的殘留就應該在可以滿足實驗要求的水平；而只有溶液的用量足夠，甚至過剩，才能確保裂解和中和是徹底的。當然，試劑盒及苯酚的使用，是可以更進一步降低蛋白質的殘留的。

降低質粒Nick的方法

細菌收獲時間，菌株的選擇，抽提操作的劇烈程度是影響 Nick 的三個主要因素。細菌收獲過早，質粒還在復制過程中，Nick 的比例較高；過晚，細菌開始死亡，雜質會比較多。如果使用胞內酶含量很高的宿主菌，會出現較高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混勻操作，也可以導致一些 Nick，但影響不會比前兩者大。

降低變性超螺旋的方法

理論上，用鹼裂解法抽提質粒，變性超螺旋的出現是不可避免的。之所以大家沒有非常在意，一是因為它的存在似乎對酶反應沒有任何影響，二是因為它的含量並不一定高到被用電泳觀察到。抽提使用相對過剩的溶液，在加入溶液 II 後，體系能在 1 分鍾內變澄清，再快速加入溶液 III，這樣基本上能將變性超螺旋的出現控制在電泳看不見的水平。 (變性超螺旋電泳時比正常超螺旋跑得快一點點。)

關於質粒多聚體

QIAGEN 提供了一個沒有進一步解釋的觀察：從有些宿主菌中抽提質粒 (pTZ19)，電泳能發現很多條帶；但使用單酶切後，仍然變成一條帶，大小正好是線性單質粒的大小。根據這一觀察，可以推理如下：那些大的條帶(質粒多聚體)是由完整的單質粒「粘」在一起形成的，而不是我的一條鏈與你的一條鏈復性在一起；第二，這種「粘」只是部分的，否則酶切會有問題；第三，這種「粘」是脆弱的，線性後的剛性足以打破它。如果是這樣，質粒多聚體的出現與質粒的結構及序列有關，可以不管它(也管不了)，因為它不影響酶切，或者說，即使質粒多聚體切不動，也不會影響太大。總之，碰到這種情況，不要簡單地認為有問題，而是應該一步一步往下做，但一定要做完一步，檢測一次，看一看結果與預期的吻合程度。

提高得率的方法

利用氯黴素抑制染色體的復制，而不抑制質粒的復制這一特點，在低拷貝質粒（如pUC19）的培養過程中添加氯黴素可以大大提高得率。

2. 蛋白質葯物的分離純化方法

蛋白質組 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，並且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯後的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. 蛋白質組學(Proteomics)處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、葯物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離後的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
[編輯本段]蛋白質組學的研究內容
主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面：
① 針對有關基因組或轉錄組資料庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。
② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。
③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為「細胞圖譜」蛋白質組學。
此外，隨著蛋白質組學研究的深入，又出現了一些新的研究方向，如亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學等。
[編輯本段]蛋白質組學研究中的主要技術
1 雙向凝膠電泳技術(2-DE)
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、解析度和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯醯胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用資料庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高解析度的蛋白質分離及准確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的解析度，同時也影響後續的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒游標記的樣品，並第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質採用不同的熒游標記後混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的准確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，並且軟體可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經在各種樣品中得到應用。
2 高效液相色譜技術(HPLC)
盡管二維凝膠電泳（2-DE）是目前常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對於分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌症兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，並用MALDI-TOF-MS 鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便於自動化等特點。二維離子交換- 反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。

3. 蛋白質層析、超濾常用技術手段

在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。

供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .

為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.

4. 樣本前處理（三）

蛋白提取的質量控制

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

脫鹽

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

Tips :

樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對樣品造成影響，我們提取蛋白時使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話，造成樣品體積太大，下一步加入酶後，則酶和蛋白的濃度會特別低，酶解效果受到很大影響。另外，體積太大處理起來也不方便。這時也可以使用超濾的方法，多步稀釋，將尿素的濃度降到1M以下。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

還原烷基化及酶解

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

Tips :

如果做iTRAQ（或TMT）標記，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系。因為iTRAQ（或TMT）試劑是標記末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會被標記上，影響蛋白的標記效率。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

蛋白質及肽段的預分級

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

Tips :

通常，我們通過RPLC與質譜聯用。因為RPLC體系是用水和乙腈，易揮發，不含鹽，可以直接送入質譜進行檢測。而像SCX/SAX這類正相柱，需要通過高鹽的體系將樣品洗脫下來，所以它與質譜不兼容。我們在做多級分離時，前面都會有各種鹽的洗脫，最後才是RPLC，然後就可以直接連質譜了。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

一篇2013年發表在MCP上的文獻報道，採用RP-RPLC兩級分離，分成常規的24個餾分，上樣量為100μg，在一天內能檢測到8000多個蛋白。

一篇2013年發表在Nat Comm上的文獻報道，先採用RP柱分級，再使用SAX分離，然後通過1米的長柱子反相色譜分離。樣品為人的胚胎幹細胞，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測了9818個蛋白，如果分離時間延長到24天，則可以檢測13075個蛋白。

一篇2014年發表在Nat Method上的文獻報道，採用IEF（等電聚焦電泳，isoelectric focusing）與RPLC結合，樣品是人的上皮癌細胞，上樣量為800μg，分成了360個餾分，耗時超過15天，一共分析到13078個蛋白。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

Tips :

對於分餾分，通常是利用C18的色譜柱來分級分餾分，這個沒有試劑盒。

5. 超濾原理的超濾

⑴原理
超濾膜篩分過程，以膜兩側的壓力差為驅動力，以超濾膜為過濾介質，在一定的壓力下，當原液流過膜表面時，超濾膜表面密布的許多細小的微孔只允許水及小分子物質通過而成為透過液，而原液中體積大於膜表面微孔徑的物質則被截留在膜的進液側，成為濃縮液，因而實現對原液的凈化、分離和濃縮的目的。
⑵超濾膜與超濾裝置
①超濾膜的種類：
常用的超濾膜有：醋酸纖維素膜，聚碸膜，聚醯胺膜
②超濾裝置：主要有板框式、管式、卷式和中空纖維式等，與反滲透裝置類似。
Ⅰ板框式超濾裝置
優點：裝置牢固，適合在廣泛的壓力范圍內工作；流道間隙大小可調，原水流道不易被雜物堵塞；具有可拆性，清洗方便；通過增減膜及支撐板的數量可處理不同水量。
缺點：裝置較笨重；單位體積內的有效膜面積較小；膜的強度要求較高，一般做在無紡布上，以增強膜的機械性能。
Ⅱ管式超濾裝置
優點：原液流道截留面積較大，不易堵塞；膜面的清洗比較容易，可化學清洗或擦洗。
缺點：單位體積內膜的充填密度較低，佔地面積大；膜管的彎頭及連接件多，設備安裝費時。
Ⅲ卷式超濾裝置
優點：單位體積內的有效膜面積較大，水在膜表面流動狀態比較好，結構緊湊，佔地面積較小。缺點：進水預處理要求嚴格，對所用的膜強度要求較高，使用過程中，一旦發現膜破損須更換新的膜元件。
Ⅳ中空纖維式超濾裝置：
優點：單位體積內有效膜面積最大，工作效率最高，佔地面積小。中空纖維無須支撐物。
缺點：膜的清洗較困難，只能用水力沖洗或化學清洗，不能用機械清洗，另外，中空纖維膜損壞後要更換整個組件。
③超濾工藝參數
主要參數有膜通量、膜清洗和膜壽命。
在操作壓力為0.11～0.6Mpa，溫度小於60℃時，超濾膜的膜通量以1～500L/m2h為宜。影響膜通量的因素有：進水流速、操作壓力、溫度、進水濃度和原水預處理等。
膜必須定期清洗，以延長膜的壽命，正常使用的膜的壽命為12～18個月。
④超濾在廢水處理中的應用
如今已應用在汽車製造行業噴漆廢水、金屬加工廢水以及食品工業廢水的處理及有用物質的回收。
超濾原理也是一種膜分離過程原理，超濾利用一種壓力活性膜，在外界推動力(壓力)作用下截留水中膠體、顆粒和分子量相對較高的物質,而水和小的溶質顆粒透過膜的分離過程。通過膜表面的微孔篩選可截留分子量為3x10000—1x10000的物質。當被處理水藉助於外界壓力的作用以一定的流速通過膜表面時，水分子和分子量小於300—500的溶質透過膜，而大於膜孔的微粒、大分子等由於篩分作用被截留，從而使水得到凈化。也就是說，當水通過超濾膜後，可將水中含有的大部分膠體硅除去，同時可去除大量的有機物等。
超濾原理並不復雜。在超濾過程中，由於被截留的雜質在膜表面上不斷積累，會產生濃差極化現象，當膜面溶質濃度達到某一極限時即生成凝膠層，使膜的透水量急劇下降，這使得超濾的應用受到一定程度的限制。為此，需通過試驗進行研究，以確定最佳的工藝和運行條件，最大限度地減輕濃差極化的影響，使超濾成為一種可靠的反滲透預處理方法。
a． 超濾與傳統的預處理工藝相比，系統簡單、操作方便、佔地小、投資省、且水質極優，可滿足各類反滲透裝置的進水要求。
b． 合理地選擇運行條件和清洗工藝，可完全控制超濾的濃差極化問題，使此預處理方法更可靠。
c．超濾對水中的各類膠體均具有良好的去除特性,因而可以考慮擴大到凝結水精處理及離子交換除鹽系統的預處理中。
在超濾過程中，水深液在壓力推動下，流經膜表面，小於膜孔的深劑（水）及小分子溶質透水膜，成為凈化液（濾清液），比膜孔大的溶質及溶質集團被截留，隨水流排出，成為深縮液。超濾過程為動態過濾，分離是在流動狀態下完成的。溶質僅在膜表面有限沉積，超濾速率衰減到一定程度而趨於平衡，且通過清洗可以恢復。
超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一。以大分子與小分子分離為目的，膜孔徑在20－1000A°之間。中空纖維超濾器（膜）具有單位溶器內充填密度高，佔地面積小等優點。
超濾技術的優缺點
與傳統分離方法相比，超濾技術具有以下特點：
1. 濾過程是在常溫下進行，條件溫和無成分破壞，因而特別適宜對熱敏感的物質，如葯物、酶、果汁等的分離、分級、濃縮與富集。
2. 濾過程不發生相變化，無需加熱，能耗低，無需添加化學試劑，無污染，是一種節能環保的分離技術。
3. 超濾技術分離效率高，對稀溶液中的微量成分的回收、低濃度溶液的濃縮均非常有效。
4. 超濾過程僅採用壓力作為膜分離的動力，因此分離裝置簡單、流程短、操作簡便、易於控制和維護。
5. 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到乾粉制劑。對於蛋白質溶液，一般只能得到10～50%的濃度。
超濾裝置是在一個密閉的容器中進行，以壓縮空氣為動力，推動容器內的活塞前進，使樣液形成內壓，容器底部設有堅固的膜板。小於膜板孔徑直徑的小分子，受壓力的作用被擠出膜板外，大分子被截留在膜板之上。超濾開始時，由於溶質分子均勻地分布在溶液中，超濾的速度比較快。但是，隨著小分子的不斷排出，大分子被截留堆積在膜表面，濃度越來越高， 自下而上形成濃度梯度，這日才超濾速度就會逐漸減慢，這種現象稱為濃度極化現象。為了克服濃度極化現象，增加流速，設計了幾種超濾裝置：
1. 無攪拌式超濾
這種裝置比較簡單，只是在密閉的容器中施加一定壓力，使小分子和溶劑分子擠壓出膜外，無攪拌裝置濃度極化較為嚴重，只適合於濃度較稀的小量超濾。
2. 攪拌式超濾
攪拌式超濾是將超濾裝置位於電磁攪拌器之上，超濾容器內放人一支磁棒。在超濾時向容器內施加壓力的同時開動磁力攪拌器，小分子溶質和溶劑分子被排出膜外，大分子向濾膜表面堆積時，被電磁攪拌器分散到溶液中。這種方法不容易產生濃度極化現象，提高了超濾的速度。
4. 中空纖維超濾
由於膜板式超濾裝置，截留面積有限，中空纖維超濾是在一支空心柱內裝有許多的，中空纖維毛細管，兩端相通，管的內徑一般在0．2mm左右，有效面積可以達到1平方厘米每一根纖維毛細管像一個微型透析袋，極大地增大了滲透的表面積，提高了超濾的速度。納米膜表超濾膜也是中空超濾膜的一種。

6. 如何對PCR擴增的產物進行酶切

1. 首先確認PCR產物，取一小部分PCR產物跑膠。
2. 如果產物良好，一個特異性很強的條帶，則用過柱的方法提純（就是你平時用的從溶液中純化DNA的試劑盒就可以）。樓上說的跑膠後再提，早就過時了。效率很低。
3，提純加入限制性內切酶緩沖液，酶。按照平時的方法反應就可以了。
4. 酶切後再過柱提純就可以了。

7. sumo融合蛋白的純化時掛在Ni親和柱上時是不是就還可以加sumo蛋白酶酶切，還是必須洗下來以後才能酶切

不是絕對的，兩種方法其實都差不多。
但是柱切和洗脫後酶切還是有不同的。
柱切內比較方便，酶切容之後直接收流穿的部分就是目的蛋白。缺點是在洗脫之前不知道蛋白產量，可能努力了半天什麼都沒有，而且有些蛋白不穩定，可能在柱切過程中沉澱在柱子上了。

洗脫後再切，比較直觀的檢測初步富集的蛋白量，再決定加多少酶，而且能直觀的檢測酶切效率，確定是酶切之後要多一個去標簽的過程。

8. 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白質，可以根據其特點選擇適當的蛋白質提取純化方法！

選擇材料及預處理

以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪失。蛋白質的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、乾燥和保存。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。

蛋白質的分離純化

一，蛋白質（包括酶）的提取

大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）

（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。

濃縮、乾燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

二、乾燥

生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。

三、貯存

生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。