氨基酸分析儀陽離子交換色譜

A. 氨基酸分析儀的工作原理是什麼

不同的氨基酸結構不同,可通過紅外光譜,核磁共振氫譜等方法識別各個酸特定結構,江蘇高二化學里有.

B. 氨基酸自動分析儀測定蛋白質中氨基酸組成的原理

採用經典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱後衍生法，對蛋白質水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。儀器基本結構同普通HPLC相似，但針對氨基酸分析進行了細節優化（例如氮氣保護、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制等等）
通常細分為兩種系統：蛋白水解分析系統（鈉鹽系統）和游離氨基酸分析系統（鋰鹽系統），利用不同濃度和pH值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。其中鈉鹽系統一次最多分析約25種氨基酸，速度較快，基線平直度好；鋰鹽系統一次最多分析約50種氨基酸，速度較慢，基線一般不如鈉鹽系統好。
分析效果：從目前已知的氨基酸分析方法比較來看，除靈敏度（即最低檢測限）比HPLC柱前衍生方法稍低以外（HPLC：<0.5pmol；氨基酸分析儀：<10pmol)，其他如分離度、重現性、操作簡便性、運行成本等方面，都優於其他分析方法。

C. 氨基酸分析儀的介紹

氨基酸分析儀是一種分析儀器，採用經典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱後衍生法，對蛋白質水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。

D. 氨基酸分析法的方法分類

本法系根據氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲醯氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離後用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25&micro;mol/ml。
試劑 （1）流動相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然後加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流動相B 乙腈－水（8：2）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自「置一2ml塑料離心管中」起同法測定。 本法系根據氨基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。
試劑 （1）流動相A 取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然後加水至1000 ml。
（2）流動相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然後加水稀釋至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC適量，加乙腈溶解並稀釋製成每1ml中含1mg的溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 測定法 精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 70μl，在渦旋混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自「置一直徑為0.4cm」起同法測定。 本法系根據一級氨基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-氨基酸；反應完畢後，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩餘的二級氨基酸與FMOC繼續反應，生成FMOC-氨基酸，兩次反應生成的氨基酸衍生物經反相高效液相色譜分離後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～2.5&micro;mol/ml。
試劑 （1）流動相A 稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2%醋酸調pH至7.2。
（2）流動相B 稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然後加水稀釋至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度及流速如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 測定法 精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑料離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.2) 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自「置一1.5ml塑料離心管中」起同法測定。
附註：1、由於OPA-氨基酸不穩定，因此衍生後應立即進行分離測定。
2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。 本法系根據氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離後採用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規定外，一般不宜採用本法。
試劑 （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液(取 4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲醯胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml)。
（2）流動相B 流動相A-乙腈（1：1）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自「置一50ml量瓶中」起同法測定。 本法系根據氨基酸經陽離子交換色譜柱分離後，與茚三酮反應，一級氨基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為20～500 pmol。
試劑 （1）流動相A 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。
（2）流動相B 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。
（3）流動相C 取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。
（4） 色譜柱再生溶液 取氫氧化鈉0.8g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。
（5）柱後衍生試劑 取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7%二甲基亞碸－0.7二水合醋酸鋰－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。
（6）樣品緩沖液 2%無水檸檬酸鈉-1%鹽酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱後衍生試劑得流速為每分鍾7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm(一級氨基酸)，570nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鍾流動相的組成變為100%流動相B，在37分鍾，流動相組成變為100%流動相C，在75min，最後一個氨基酸被洗脫後，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鍾。柱溫程序如下：開始時柱溫48℃，11.5分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至65℃，約35分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至77℃，最後在約52分鍾後，以每分鍾3℃的速率降至77℃。
測定法 精密量取氨基酸對照品溶液適量，注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。
附註：不同品牌的氨基酸分析儀，應根據儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩沖液和洗脫梯度作適當調整。

E. 氨基酸分析儀的優缺點

採用經典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱後衍生法，對蛋白質水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。儀器基本結構同普通hplc相似，但針對氨基酸分析進行了細節優化（例如氮氣保護、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制等等）
通常細分為兩種系統：蛋白水解分析系統（鈉鹽系統）和游離氨基酸分析系統（鋰鹽系統），利用不同濃度和ph值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。其中鈉鹽系統一次最多分析約25種氨基酸，速度較快，基線平直度好；鋰鹽系統一次最多分析約50種氨基酸，速度較慢，基線一般不如鈉鹽系統好。
分析效果：從目前已知的氨基酸分析方法比較來看，除靈敏度（即最低檢測限）比hplc柱前衍生方法稍低以外（hplc：<0.5pmol；氨基酸分析儀：<10pmol)，其他如分離度、重現性、操作簡便性、運行成本等方面，都優於其他分析方法。

F. 離子交換色譜產生的信號值是什麼

離子交換來色譜中的固源定相是一些帶電荷的基團， 這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子。這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團主要是－NH2，及－NH3 ：陽離子交換劑的功能團主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬於強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內都有離子交換能力；-NH2及-COOH 離子交換柱屬於弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用於可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質的分離，核苷酸、核苷和各種鹼基的分離等。

G. 氨基酸分析儀的辨別

1、原理。基於陽離子交換柱分離、柱後茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜法（IEC）。此類方法由Stein和Moore兩人1958年發明，並於1972年獲諾貝爾獎，是當今國際標准和國家標准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指標。滿足分析需要的技術指標如分離度、重復性等要求，而其中的分離度又是更為重要的指標，因為，色譜理論一般以分離度達到1.2作為兩峰基本分離的判定前提，只有峰分開了，才有意義去討論定性和定量的重復性。
3、指標的真實性。有些廠家只標出個別氨基酸的指標如Asp或Arg，或只用平均數據替代全部數據等等，而儀器性能好，經營信譽較高的廠家就會標出全部氨基酸的指標供用戶參考。
4、儀器的可靠性。如果儀器今天堵了、明天漏了，用戶不僅要付出大量人力財力，分析結果的可信度也將大打折扣。
5、儀器的運行成本。例如是否可以使用國產試劑、柱子壽命（以多少次進樣計算、而不以多少年計算）等。
6、儀器設計是否有利於氨基酸分析。例如是否有惰性氣體保護（茚三酮極易被氧化）、是否提供在線脫氣、是否提供溶液和樣品的製冷控制等。
7、售後服務。分析過程中遇到困難是在所難免，廠家必須能夠快速響應、盡快解決問題。另外，常用備件的價格也是一個重要因素，因為用戶在購買前一般難以注意到售後的問題，而很多廠家也沒有公示自己的常用備件價格，這就為將來的使用埋下了隱患，事實上，也的確有很多儀器在出現一些看似微小的故障之後，就因為維修費用太高而被「束之高閣」。
我想，您要是按照以上的標准去選擇氨基酸分析儀的話，一定能夠選到滿意的儀器，成為您工作中得力的助手。

H. 如何用液相色譜儀測氨基酸

反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸
氨基酸是煙草中的一類重要化學物質，在煙草調制、醇化或發酵、加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發生酶催化及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有蒸煮、烤香、爆米花香味特徵的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量與煙草製品的吃味有著密切的關系，氨基酸在燃燒裂解過程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，對煙氣香吃味產生不良影響，個別氨基酸還產生HCN等危害健康的煙氣成分。一般說來，氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強烈；含量太低時煙氣則平淡無味缺少豐滿度。因此對氨基酸的分析是一項很有意義的工作，二十世紀60年代以來，國內外在這方面做了大量的工作[1-5]。
植物游離氨基酸樣品的制備，國內外採用的提取劑和純化方法各不相同。據文獻報道[6-7]，鹽酸、不同濃度的乙醇溶液均可以用來提取植物組織中的游離氨基酸；提取液純化則有用陽離子交換樹脂、5%磺基水楊酸、活性炭或乙醚等方法。本實驗對不同的提取方式和不同的純化方法進行了對比研究，確定提取煙葉中游離氨基酸的較佳提取劑和純化方法。提取、純化後的樣品，採用OPA、FMOC聯合柱前衍生反相高效液相色譜法對煙葉中的游離氨基酸進行了測定。該方法使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸能夠被同時測定，且得到較好的定性定量結果。
1 實驗
1.1 儀器
Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動進樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計。
1.2 試劑
正纈氨酸（Norvaline，內標），OPA ，FMOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供；
醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，Fisher公司試劑；
氨基酸標樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬醯胺（Asn）、谷氨醯胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；
苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。
1.3 樣品處理
將煙葉在烘箱中恆溫40℃烘乾至恆重，粉碎，過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末，置於廣口瓶中備用。准確稱取煙樣粉末1.000g於乾燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合並後的濾液用陽離子交換柱洗脫，然後用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恆溫濃縮至干，最後用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內標10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進行氨基酸分析。
樣品自動柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動進樣器進樣。程序為：吸取5μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進樣。
1.4 色譜條件
色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流動相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。
流動相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，並混合均勻。
流速：0.45ml/min
柱溫：40℃
紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：見表1
表1 流動相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用標樣色譜圖、文獻參照和標樣加入的方法，通過對照保留時間進行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認。
1.6 內標法定量
准確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣100μl於帶內襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內標溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動計算各氨基酸的標准曲線。
2 結果與討論
2.1 萃取溶劑的比較
氨基酸可溶解於水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實驗發現，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實驗選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。
2.2 乙醇濃度的選擇
選擇五種不同濃度的乙醇溶液進行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進行煙樣中游離氨基酸的提取。

2.3 不同純化方法的確定
在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質、乙醚加入提取液萃取分離雜質、5%磺基水楊酸加入提取液沉澱去除雜質和陽離子交換樹脂吸附雜質四種方法進行了純化實驗。結果發現，活性炭作為純化劑時其色譜圖中雜質峰較少，但同時氨基酸峰亦有多個消失，主要是因為活性炭對氨基酸也有較強的吸附，它在吸附雜質的同時也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時，雜質去除不完全，其色譜圖均表現為雜質峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴重，給定性定量工作帶來困難。當用陽離子交換樹脂進行純化時，其色譜圖中雜質峰較少，基線平穩，氨基酸峰分離較好，均可以進行定性和定量分析，故本實驗選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。
2.4 色譜分離
2.5 線性范圍及標准曲線
分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣加入等體積的250 pmol/μ1的內標溶液，進行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標，氨基酸與內標的面積比為縱坐標，得到各個氨基酸的標准曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內均有良好的線性，各氨基酸標准曲線的線性相關系數均大於0.99。
表2 氨基酸的標准曲線
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 線性方程 相關系數
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重現性實驗
取雲南C2F99煙樣做平行實驗（n=5），進行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結果發現： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。
2.7 回收率實驗
用標樣加入法進行回收率實驗，結果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結果令人滿意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 樣品分析
利用該方法對不同等級的煙葉中游離氨基酸的含量進行了分析，結果見表4。從表中可以看出，在所分析的樣品中，烤煙煙葉中含量最高的氨基酸是Pro，白肋煙煙葉中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋煙煙葉中氨基酸的含量高於烤煙煙葉；相同等級的烤煙煙葉，雲南煙葉中的氨基酸含量高於其它產區。
表4 不同等級煙葉中游離氨基酸的含量（mg/g煙樣）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 雲南烤煙C1F 雲南烤煙C2F 雲南烤煙C1L 雲南烤煙B1F 雲南烤煙B2F 福建烤煙B1F 福建烤煙C1F 四川烤煙C1F 四川烤煙B1F 貴州烤煙C1F 貴州烤煙B1F 貴州烤煙C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
總量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 結論
本煙葉中游離氨基酸的分析方法採用80%的乙醇作為萃取溶劑，陽離子交換樹脂對提取液進行純化，能夠最大程度地提取煙葉中的游離氨基酸並較好地去除了影響氨基酸測定的雜質，使色譜圖中雜質峰較少；OPA、FMOC聯和柱前衍生使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸同時得到測定；良好的梯度洗脫使各個氨基酸峰得到較好的分離，並使定量結果更加可靠。

I. 氨基酸分析儀的色譜柱是什麼填料的壽命大概能有多久能自己裝填嗎

您好來，我是德國曼默博爾公司自的工程師。
氨基酸分析的色譜柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合後磺化成的磺酸型強酸性陽離子交換樹脂。
其實，色譜柱壽命主要看自己使用時候保護的怎麼樣：包括樣品前處理是否規范，維護保養是否充分等。一般注意點使用的話，保證柱效的情況下，壽命能保證在1萬-2萬針左右，多的話也有可能，看你怎麼用了。有的廠家會吹噓能到6萬針，簡單計算下氨基酸分析一個樣大概得1小時左右，除去維護時間，一天最多跑個20針，一年也就6000針左右，10年才能跑完6萬針，到時候儀器報廢沒報廢都不知道，別說色譜柱了。
色譜柱的裝填是非常需要經驗和技巧的活兒，而且裝色譜柱得需要非常專業的色譜柱裝柱機。比如裝色譜柱的時候得用恆壓泵裝，一般實驗室儀器都配置的是恆流泵，恆流泵裝出來的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、勻漿等都非常需要經驗，要是自己裝估計很難，一般得找專業的色譜柱工程師裝填最好。
希望對您有幫助，記得給分

J. 氨基酸用離子交換柱,色譜柱為什麼需要平衡啊

如果你用的是一般的液相色譜儀,需要很長的時間平衡柱子和系統,因為離子交換柱對流動相中的離子很敏感,一般的液相色譜儀內壁是金屬的,多會產生離子或靜電荷,對分析造成干擾.推薦用離子色譜儀,或氨基酸分析儀,不過也要平衡一定的時間