⑴ 用鎳柱純化過得蛋白還能再進行離子交換嗎
你可以試試。只是鎳柱本質上也是靠電荷吸引力來純化蛋白，和陰離子交換層析有些類似，那些鎳柱無法去除的雜蛋白能否被陰離子交換層析去除，可能需要打個問號。不過兩次純化效果應該比一次好吧。
⑵ 蛋白過鎳柱純化的原理和步驟是什麼
Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的蛋白結合，也可以與咪唑結合。
步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化鎳，一個柱長體積就行了，然後平衡柱子，拿你自己的buffer，給蛋白提供最適的環境，我一般平衡4個柱長，然後蛋白上樣，你可以讓他自己掛，這樣掛柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加個恆流泵，但是一定不能太快，太快掛柱效果差，當然你也可以選擇循環掛柱，就是恆流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯，從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去。掛完之後，按理想來講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就結合了，雜蛋白多數在燒杯里，留下來了，當然肯定有少量雜蛋白也掛上了，這時候你要梯度洗脫，拿咪唑和你的buffer配，一般從0 20mM 40mM。。。。100mM這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概在什麼時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度。咪唑加入之後，會和蛋白爭奪與Ni的結合位點，雜蛋白、你的目的蛋白，會在不同的濃度被洗脫下來，洗完之後，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然後平衡幾次，是否選擇重生你自己定咯~然後放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
過的蛋白用不同的管子收下，然後SDS-page檢測在哪個管子里。
這是我的經驗，樓主可以多方面參考下別人的。喜歡推薦我的答案哦，~\(≧▽≦)/~
⑶ NI-NTA蛋白提純的原理是什麼
NI-NTA蛋白提純的原理如下：
Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白)標簽的鹼性蛋白蛋白結合，組蛋白標簽一般是6個組氨酸(鹼性氨基酸)。在蛋白上樣後，帶有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結合這時候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競爭性結合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集浸出液，那麼裡面就是目的蛋白，然後透析掉咪唑。
Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白)標簽的鹼性蛋白蛋白結合，組蛋白標簽一般是6個組氨酸(鹼性氨基酸)。在蛋白上樣後，帶有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni-NTA純化介質是Ni離子金屬螯合介質。高親和Ni-NTA純化介質(L00250)是把螯合劑(氮川三乙酸或NTA)共價偶聯到瓊脂糖介質(4%交聯)上，然後再螯合Ni2+制備而成。NTA能夠通過四個位點牢固的螯合Ni2+從而減少純化過程中Ni2+泄露到蛋白樣品中。Ni-NTA純化介質可以純化任何錶達系統(原核，酵母，昆蟲細胞和哺乳動物(mammal;mammalian)細胞等表達系統)表達的天然或變性的His-標簽蛋白。結合在介質上的蛋白可以通過低pH緩沖液、咪唑溶液甚至組氨酸溶液洗脫下來。
⑷ 鎳柱純化蛋白為什麼加pmsf和dtt
加PMSF是因為PMSF是一種蛋白酶抑制劑，可以有效的抑制菌體裂解後的釋放出的絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的活性。防止它們降解消化目標蛋白。需注意PMSF溶解於水溶液後自身會迅速降解，大約1小時會自身降解完畢即失去作用。需要每1小時補加一些新鮮的PMSF。
加DTT是因為DTT是一種還原劑，可以打開蛋白質的二硫鍵，阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵。避免His-tag被包裹在蛋白結構的內部導致目標蛋白不能結合鎳柱。需注意DTT會還原鎳柱上的鎳離子，可能會造成鎳離子的脫落而影響柱效。
⑸ 蛋白過鎳柱純化的過程 我是初學者，所以麻煩大家給的詳細一點 謝謝啦！
見http://..com/question/292063616.html或
鎳柱分離純化
固定金屬離子親和柱主要用於金屬螯化離子。位於許多蛋白中的組氨酸殘基將會和許多金屬離子，例如鋅。銅，鎳，鐵等形成復合物。因此，該柱料能選擇性螯合一些具有組氨酸殘基的蛋白質。但是半胱氨酸和咯氨酸殘基也能和固定化金屬螯和。但是親和力比組氨酸要弱。所以，結合的強度是和緩沖液的PH和金屬離子決定的。
金屬螯和柱料主要是由亞氨基的乙醯乙酸成分耦聯瓊脂糖柱料，藉助醚長生7個原子的空間。
全部容量：24-30um的含有zn的干膠
柱料結構：6%的高鉸鏈的瓊脂糖
柱料大小：45-165um
平均微粒：90um
直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小時可達700厘米
最大壓強：0.3MPa
PH變化：長期3-13
短期2-14
化學穩定：通用含水緩沖液
0.01M鹽酸，1.0M NAOH, 20%乙醇（保存7天）
物理性質：可以忽略在PH或者離子變化下的體積變化
耐熱性能：121度下0.1M乙酸鈉作用半小時
金屬螯和柱料保存於事先填充於20%乙醇。所以要攪拌驅除20%乙醇溶液。換成去離子水。比例是25%去離子水和75%處理膠。
處理金屬螯和柱料：
1 平衡所有用到的材料於室溫。
2 攪拌金屬螯和柱料
3 倒水進柱子，驅除氣體。用無離子水液封幾厘米。
4 將金屬螯和柱料連續倒進柱子，用玻璃棒支撐柱壁防止氣泡形成。
5 然後立即用無離子水液封，裝上柱蓋，連接上泵。
6 打開柱子底部的開關，然後調節泵的流速。通常是不超過0.3MPa的。
7 經過一個穩定的柱床填鴨後，維持填壓速度為3個柱床。
使用adaptor
1 經過上溯填鴨後，關閉柱床下面開關，移開上面的薄膜，小心的加上去離子水進行液封。
2 一定角度插入adaptor，確保沒有氣泡。
3 確保所有的連接都沒有問題，柱子/泵/樣品接受器
4 傾斜插入活塞確保沒有氣泡和管道充滿液體。利用活泵正反向的流動確保沒有氣泡。
5 固定adaptor，打開柱子開關，開始緩沖液的流動。先以填鴨的速度直到柱床穩定後。
固定金屬離子：
金屬螯和柱料通過水來螯和金屬的，避免發生沉澱在膠上。
1 確保柱子已經平衡好。如果有必要可以洗2個柱床（去離子水）
2 選擇金屬離子和0.1-0.3M中弱性酸。例如鐵離子PH 3左右就好，避免形成沉澱和共沉。
3 加入一倍柱床的金屬離子溶液
4 5倍柱床的去離子水洗滌
5 至少2倍柱床的平衡緩沖液
結合：
發生於PH5.5-8.5之間.最強反映發生於最後
初始緩沖液的選擇決定於金屬離子和樣品的結合性質。乙酸鈉或者磷酸鈉是比較好的緩沖液中不能使用EDTA或者檸檬酸鹽
最通用緩沖液：
0.01-0.2M磷酸鈉
0.05M乙酸鈉
強烈推薦加入0.15-0.5M NaCl用於防止離子交換。
通常如果不知道一個蛋白的結合能力，最好的就是使用鋅離子和中性的磷酸或者乙酸鹽，同時含有0.15-0.5M NaCl
去垢劑不會影響蛋白質的結合能力
金屬離子的取代意味著蛋白發生了結合。這種現象可以通過顏色來決定
洗脫蛋白：（3種方法）
1 降低PH(一步或者分步)，大部分蛋白溶解於PH4-6最終3-4是可容的。可選擇檸檬酸鹽，磷酸或者乙酸鹽。
2 逐步提高咪唑的濃度（0-0.5M），梯度變化最好是在初始緩沖液的PH范圍。
3 加入EDTA或者EGTA可洗脫蛋白質。但是不是通用的。
利用離心或者重力作用純化組氨酸位點蛋白
通過上鎳進行選擇性結合含有組氨酸位點蛋白，然後利用含有咪唑的緩沖液洗脫蛋白。
以下的實驗是為了最大化將組氨酸位點蛋白結合到金屬螯和柱料，然後確保能夠洗脫下來。當結合和洗脫的條件尚未明了時，這些方法也是很好用的。
為了獲得高純度的蛋白，必須摸索咪唑的緩沖液在樣品上柱和洗脫時的濃度。通常使用10mM-500mM范圍的咪唑的緩沖液進行剃度洗脫，然後通過收集和SDS-PAGE 蛋白電泳確定洗脫濃度。
為了純化不可容的含有his位點的蛋白質，（包含體），可以在變性條件下進行。利用8M尿素或者6M鹽酸呱進行溶解蛋白。
樣品處理：
樣品要經可能溶解，避免出現堵塞現象，所以可以利用0.45uM慮膜過濾雜志
如果樣品時溶解於20mM磷酸緩沖液中（含有0.5M Nacl,PH7.4），必須調整PH到7－8。
上柱前准備：
洗柱料：
1 親柔震動膠瓶充旋膠料
2 利用吸管吸出足量柱料用以純化目的。每毫升柱料可以吸納5毫克蛋白
3 500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
4 小心去除上清
5 加入5倍體積去離子水，充分振盪柱料。可以倒置來回5分鍾，不要機械攪拌。
6 再次500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
7 再次小心去除上清
掛鎳：
1 加入0.5倍柱床體積0.1M硫酸鎳，充分振盪柱料。可以倒置來回5分鍾，不要機械攪拌。
2 500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
3 小心去除上清
洗柱：
1加入5倍體積去離子水，充分振盪柱料，來回倒置5分鍾
2 500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
3小心去除上清
4 再洗兩次柱料（一共3×5柱床去離子水）
5 最後用一倍體積起始緩沖液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）
利用離心來純化：
上樣：
1 在起始緩沖液中加入樣品，然後使整體膠濃度達到50％
2 親柔攪拌，室溫離心5－30分鍾，結合能力取決於蛋白和樣品濃度。
3 500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
4 取出上清。部分用於SDS-PAGE 蛋白電泳
洗膠：
1 加入5倍體積起始緩沖液，攪拌5分鍾
2 500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
3取出上清。部分用於SDS-PAGE 蛋白電泳
4再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用於SDS-PAGE 蛋白
電泳
洗柱：
1 加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鍾
2再次500g 離心2－5分鍾，沉澱柱料。
3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用於SDS-PAGE 蛋白電泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
利用流速和重力純化：
1 在柱子底部加上濾器
2 加水排氣
3 加柱帽，去除殘余水。推薦是最多2 Ml柱料就可以了
樣品結合：
1 倒膠進入柱子
2 小心上樣，用波棒室溫攪拌5－30分鍾
3 打開柱帽，收集流出峰用於分析
洗膠：
1 加入5倍體積起始緩沖液，收集流出液用於SDS-PAGE 蛋白電泳
2再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用於SDS-PAGE 蛋白
電泳
洗柱：
1 加上柱帽，加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鍾。打開柱帽，收集流出峰
2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用於SDS-PAGE 蛋白電泳，280nM吸光值，ELISA,WESTERN
注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5
常見問題：
1 樣品太粘稠
答：核酸存在影響，可以繼續超聲，加入RNA酶至10ug/ml DNA酶至5ug/ml。然後冰浴1
0－15分鍾。或者也可以用注射器來回充旋。這樣可以防止堵塞柱料。
2 平衡時樣品洗脫了下來
答: 檢查PH和緩沖液成分，如果緩沖液成分不正確，EDTA加入，強還原劑加入，都會導致這個現象出現。
加大膠的量，如果膠料承載能力過頭，也繪出出現這現象。
准備新鮮的柱料，如果柱料斷裂，也掛不上蛋白。
3 在洗脫液中不含有組氨酸蛋白
答：如果SDS-PAGE 蛋白電泳已經發現蛋白存在於超聲液中
超聲可能不完全。可以用顯微鏡觀察超聲情況。AD260/280比值。（通常是超聲前將10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL，PH6-8），避免發泡以降解融合蛋白。
蛋白可能是是包含體，可以使用4－6M鹽酸呱或者4－8 M尿素溶解。
尿素溶解的可以進行SDS-PAGE 蛋白電泳，鹽酸呱溶解的不可以進行SDS-PAGE 蛋白電泳，必須換緩沖液。
洗脫液濃度太稀，可以加大咪唑濃度或者降低PH 來決定最佳洗脫條件如果在平衡前的洗柱發現了目的蛋白，證明起始緩沖液中的咪唑濃度太高，可適當降低。
4 考馬氏亮藍或者銀染發現多條帶
答：加入蛋白激酶抑制劑。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必須去除絲氨酸蛋白酶抑制劑採用梯度咪唑來洗脫蛋白。在平衡洗脫液中加入10mM咪唑可以洗脫大量雜質而不會洗脫融合蛋白。低於500mM咪唑可以洗掉絕大部分雜質。
在洗脫步奏往起始緩沖液加入去垢劑（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巰基乙醇。記得雜質通常沒有特意結合能力，可以改變緩沖液來洗脫。
如果雜志和目的蛋白有相同結合能力，那就不能用於純化。因此可以使用別的純化系統，例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽瓊脂糖4B
柱料再生，清潔和保存
柱料再生：
1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl來洗脫鎳離子。然後用3柱床的0.5M NaCl來洗干凈EDTA
2如果是鐵離子可以用0.05M EDTA泡過夜
3 這一步可以洗脫上面未能洗脫的殘余結合蛋白
清洗柱料：
1 0.5倍柱床2M NaCl，反向洗脫10－15分鍾
2 1M NaOH洗1小時去除殘余蛋白
3 每一步都要用3倍柱床起始緩沖液清洗
4 4倍柱床70%乙醇洗脫強親水蛋白和脂類蛋白。
也可以使用2倍柱床去垢劑。0.1-0.5%非離子去垢劑溶於0.1M乙酸。浸泡1－2小時。最後用5個柱床的70％乙醇去除去垢劑。
清潔：
1 盡可能去除微生物
2 0.5-1M NaOH反向流動半小時
3 再用3－5倍柱床消毒的起始緩沖液平衡
4 這個清潔步奏不一定能夠提高純化能力
保存：
長期保存於20％乙醇或者0.01M NaOH 於4度
以上來自網路文庫，希望能幫到你。
⑹ 在純化蛋白時，鎳離子有什麼作用
鎳柱純化his-tag
protein是常用的方法。原理大概就是his上有咪唑雜環，這個環可以帶有很多電子，可以與含正電的金屬離子發生親和反應。由於蛋白質是兩性的，所以當pH變化時，帶電也會發生變化，所以可以控制pH進行親和/洗脫，從而純化目的蛋白。
⑺ 分子篩，親和，離子交換三種層析方法比較，具體蛋白質樣品如何選擇此類方法
現在做異源表達親和用的多，因為可以在目標蛋白上加入譬如6xHis這樣的標記，然後用鎳柱分離
根據目標蛋白的分子量，用分子篩根據大小來獲得目標蛋白，同時還可以除去雜質
離子交換需要你知道目標蛋白的性質，除非對該蛋白很熟悉才用
⑻ 酸性蛋白可以進行鎳柱純化嗎
可以用鎳柱，蛋白質通過含有的組氨酸中的咪唑基團與鎳離子發生靜電作用，從而結合到鎳柱上，結合會發生在pH值5.5-8.5之間，pH越大結合作用越強，結合能力也跟要純化蛋白本身性質有關。
請根據實際情況（自然蛋白或重組蛋白）選擇合適pH的緩沖液（一般是用8.0），但是請注意如果你用的是Tris，HEPES，MOPS等的緩沖液時，請控制濃度在100mM以下，若濃度過高，其中的伯胺或叔胺基團會將鎳離子還原。
⑼ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼
常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。