① 粗蛋白測定中消煮過程中為什麼會有沉澱物怎樣避免沉澱物發生
醋蛋白測定中消除過程中是由社會有沉澱物的,這個正常情況下是不可避免的
② 我純化的蛋白總是有沉澱,該怎麼辦 已經改過鹽濃度,沉澱還是在啊
剛純化完就有沉澱?那上樣的時候應該也有沉澱吧?
復性時出現沉澱是比較難解決,溫度不要變化太大、速率降低點、濃度低點、加甘油保護劑等。
③ 如何將蛋白質溶液中的水去掉,從而將蛋白質的濃度提高急~~~
1.可以加入丙酮等有機溶劑,使蛋白析出,然後離心收集沉澱,沉澱用去離子水再溶解,去回離子水答量可根據實際需要添加,從而改變蛋白濃度。但該法可能有損蛋白活性。
2.使用透析袋,外側加聚乙二醇乾粉,使水慢慢滲出,該法可維持蛋白活性,但時間較長。
3.使用旋轉蒸發,但針對溫度不敏感的蛋白
4.凍干機凍干,但有些極端。
④ 蛋白在超濾管濃縮過程中出現沉澱怎麼辦
1、選擇合抄適的超濾管,主要考慮襲MWCO和濃縮體積,最常見的是Ultra-15(10kD)。
通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。
若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書,注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同,表格中有。
2、新買來的超濾是乾燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂的白線為准。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。
注意,一定要等離心機達到目的轉速之後,方可離開
離心機,否則離心機出問題時,無法第一時間處理,後果不可預測!膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中,一般轉速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。
⑤ 蛋白用超濾管濃縮容易沉澱怎麼辦
可能是抄這個蛋白的水溶性較差,也就是只能保持在一定濃度不能太高
另外就和這個蛋白的穩定性有關了,超濾時保持低溫,體積縮小一點後就把濾液混勻避免局部濃度過高,選擇更合適的緩沖液,添加一點甘油等小分子物質等都可以增加蛋白的穩定性。
⑥ 蛋白質在透析的過程中為什麼會出現沉澱
出現絮狀沉澱是很正常的現象,因為透析本身就是一個復性的過程,那麼出現絮狀的沉澱就是一些不能夠復性成為天然結構的一些目的蛋白和一些雜蛋白,而這些都是我們所不需要的。所以說出現絮狀沉澱是正常的也是我們希望看到的。
至於出現沉澱的原因不外乎條件變化太劇烈了,建議不要讓透析的條件變化太劇烈了,主要是PH的濃度的變化和樣品中一些其他東西如尿素的濃度變化。
如果樓主透析樣品中出現太多的沉澱,甚至於跑膠中基本沒有帶了,那麼建議樓主換一種透析液來用,如用TGE也就是傳說中的萬金油來試試,我一直用的是這種透析液,效果很不錯。TGE配法如下:
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10%甘油
如果有條件加入1%的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽會更好些。
⑦ 為什麼球蛋白在透析過程中(除鹽)易發生沉澱析出
鹽濃度對蛋白質的活性還是比較關鍵的。
我覺得你的解決方法可以從下面幾個回方面去考慮答。
第一加一些保護劑,如蔗糖,甘油,巰基乙醇等。
第二,如果你僅僅為了脫鹽的話,減少脫鹽時間。考慮用超濾或者G系列的凝膠脫鹽,這樣時間較快,減少蛋白質的變性。
第三,增加你的蛋白質濃度,一定程度也可以減少透析過程中蛋白質的沉澱,但是效果不是特別好的。你可以試試。
望採納 O(∩_∩)O謝謝
⑧ 蛋白質的溶解特性與沉澱原理
蛋白質通過鹽析的辦法沉澱的原理是降低蛋白質的溶解度,使蛋白質內凝聚而從溶液中容析出。
蛋白質的沉澱(protein
precipitation),沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。蛋白質從溶液中析出的現象,稱為蛋白質的沉澱。蛋白質沉澱常用的方法有鹽析、等電點沉澱、有機溶劑沉澱、生物鹼試劑與某些酸(如三氯醋酸)沉澱等。
⑨ 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管(MWCO10kD)。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選,視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管,主要考慮MWCO和濃縮體積,通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂的白線為准。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中,一般轉速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時,【取50ul國產Bradford溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,用5mg/ml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測】,繼續加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱,導致堵管。若發生沉澱,要確定沉澱的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決,後者的方法是換不同的Buffer,直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾),再濃縮至1ml左右,連續三次,最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定,一般不多於500ul,也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達到1000倍以上,基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作,用黃槍頭(200ul)取,輕輕順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打、混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然後吸取濃縮液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取,否則難度太大,有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中,沒過超濾膜,防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管,重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水,用milliQ水輕輕潤洗幾次,【若管底有可見的蛋白沉澱,可以先加入水,然後用槍頭吹打,注意不要碰到膜,吹打至沉澱懸起,然後倒掉,不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液,室溫放置20min,期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液,將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時,不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗,內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯,加至接近滿的MilliQ水,50ml管也加滿MilliQ水,將管芯慢慢放入50ml
離心管,排出部分水,然後蓋上蓋子,放4度保存,直到下次使用。一般來說,按照上述步驟和注意事項,每根管用三四年不會壞。