離子交換純化單抗

① 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

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對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

② 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性

1. 因為抄離子交換吸附蛋白質並不是特異性吸附，在某些情況下可能難以判斷結合的蛋白質是否為當初設計的目的蛋白。

2. 離子交換吸附依賴於蛋白質表面的靜電荷，如果蛋白質結構比較特殊，可能會有在各種pH都難以結合上離子交換層析的情況。

3. 離子交換層析對於等電點與目標蛋白接近的雜蛋白並沒有很好的分離效果。

③ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性

1，離子交換樹脂固定床的床層壓力會隨著分離過程的進程而不斷加大，需要重回新填充答。同時，也造成固定床填充過程操作麻煩，而且密封性要求高。2，蛋白質分離純度問題，如果在出峰之後再行切換接收餾分，而在峰行下降後提前切換，雖可以保證純度，但蛋白分離收率則會下降。3，由於交換層析介質決定，不同蛋白質相互分離效果也不確定，這種分離，也易造成各蛋白峰重疊，造成分離純度下降。4，自動化程度不高。主要也是受固定床以及樹脂交換飽和當量無法保持長期穩定造成的。無法像液相色譜柱那樣，可以在標樣標定後，建立方法，自動分離目標蛋白。5，不過，規模化分離純化蛋白質過程，使用這種層析法，還是具有一定優勢的。
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詳細資料請參考：
離子交換層析: http://proct.bio1000.com/100474/

④ 採用離子交換柱純化蛋白時，洗脫採用的離子強度的大小范圍應該如何確定

離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力內不一樣人達容到分離的目的的一種分離技術。離子交換劑是含有若幹活性基團 的不溶性物質，即在不溶性母體上引入若干可解離基團而成，根據引入解離基團的不同，可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。各種離子對離子交換劑的親和力各 不相同，親和力隨離子的價數與原子序數增加而增加，而隨離子水化膜半徑的增加而降低。對具體離子交換純化，需要主要離子交換劑的選擇和處理。洗脫不同蛋白 的最恰當的離子強度液不一定一樣，通常採用濃度梯度和PH梯度相結合的方式洗脫，純化不同的蛋白最好先摸一摸洗脫液的離子濃度和PH值……
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離子交換介質 http://proct.bio1000.com/100025/

⑤ 用離子交換層析分離純化生物大分子時應考慮的因數有哪些

生物大分子自身電荷及其在不同條件下的變化情況。

⑥ 離子交換法的純化方法

若將離子交換法與其他純化水質方法(例如反滲透法、過濾法和活性碳吸附內法)組合應用時，則離子交容換法在整個純化系統中，將扮演非常重要的一個部分。離子交換法能有效的去除離子，卻無法有效的去除大部分的有機物或微生物。而微生物可附著在樹脂上，並以樹脂作為培養基，使得微生物可快速生長並產生熱源。因此，需配合其他的純化方法設計使用。

⑦ 離子交換層析與疏水層析有何區別

離子交換層析是利用蛋白質在不同PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離蛋白的。離子交換內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F-如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。

⑧ 單克隆抗體的純化技術操作步驟

從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉澱法

（1）飽和硫酸銨溶液的配製

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質含量的測定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3

（5）分裝凍存備用

2、辛酸-硫酸銨沉澱法

該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。

3、優球蛋白沉澱法

該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。

缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。

⑨ 離子交換層析的原理是什麼 已解決

離子交換層析法是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物內質的酸鹼性容，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。

層析開始前，功能基團與反離子穩定結合，就與反離子發生可逆交換，與層析劑結合被固定下來。因為鹽離子可以與底物競爭功能基團，鹽濃度越高樣品與層析劑結合越不緊密，易被洗脫下來。不同物質與層析劑結合程度不同，洗脫下來的時間不同，因此得以分開。

(9)離子交換純化單抗擴展閱讀

離子交換劑的選擇首重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱，陰陽離子交換劑的選擇若被分離物質帶正電荷，這些鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑。

在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生，若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌。