⑴ 制備固定化酶的方法有哪些競爭性抑制劑有何特徵如何消除它對酶的抑製作用
1固定化酶的傳統制備方法
1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。
顯著特點是：
工藝簡便及條件溫和，包括無機、有機高分子材料，
吸附過程可同時達到純化和固定化；
酶失活後可重新活化，
載體也可再生。
但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面
1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物不適用。
(1)網格型
將酶或包埋在凝膠細微網格中，製成一定形狀的固定化酶，稱為網格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶。由於形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。
1.3結合法
酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結合而使酶固定的方法，叫離子鍵結合法。其間形成化學共價鍵結合的固定化方法叫共價鍵結合法。共價鍵結合法結合力牢固，使用過程中不易發生酶的脫落，穩定性能好。
該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜，反應條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。
1.4交聯法
交聯法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯，使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯網架結構，除了酶分子之間發生交聯外，還存在著一定的分子內交聯。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：
(1)
單獨與酶作用；
(
2)
酶吸附在載體表面上再經受交聯；
(
3)
多功能團試劑與載體反應得到有功能團的載體，再連接酶。交聯劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯苯胺、N，N-乙烯馬來醯亞胺等。
交聯法的優點是酶與載體結合牢固，穩定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復雜，進行化學修飾時易造成酶失活
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競爭性抑制劑與被抑制的酶的底物通常有結構上的相似性，能與底物競相爭奪酶分子上的結合位點，從而產生酶活性的可逆的抑製作用。與酶的活性中心相結合。與酶的結合是可逆的。
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增大底物濃度可以減弱競爭性抑制劑的影響。
⑵ 在本實驗中使用了有機溶劑純化多糖，有其他替代的試劑或方法嗎
多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布於自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內。20世紀60年代以來，人們逐漸發現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用[10]，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學作用[6]，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用[7-8]，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能[11]。
另外，多糖作為葯物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。
由於多糖具有的生物活性與其結構緊密相關，而多糖的結構又是相當復雜的，所以在這一領域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 熱水浸提法：
1.1.1多糖提取條件的優選
根據文獻報道[13]：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時間、提取次數、溶劑體積、浸提溫度、pH值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗前對上述多種因素利用正交實驗法做出優選，才能選出最佳提取方案。
1.1.2其步驟為：原料→粉碎→脫脂→粗提（2－3次）→吸濾或離心→沉澱→洗滌→乾燥
首先除去表面脂肪。原料經粉碎後加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加熱攪拌或迴流1－3小時，脫脂後過濾得到的殘渣一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀鹼性水液、氯化鈉水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90－100℃，攪拌4－6小時，反復提取2－3次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為鹼性則需要中和）。然後濃縮，再加入2－5倍低級醇（甲醇或乙醇）沉澱多糖；也可加入費林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質結合生成不溶性絡合物或鹽類沉澱。然後依次用乙醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干後疏鬆的多糖迅速轉入裝有五氧化二磷和氫氧化鈉的真空乾燥器中減壓乾燥（若沉澱的多糖為膠狀或具粘著性時，可直接冷凍乾燥）。乾燥後可得粉末狀的粗多糖。
1.2 微波輔助提取法：
其原理為利用不同極性的介質對微波能的不同吸收程度，使基體物質中的某些區域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質從基體或體系中分離出來，進入到介電常數小，微波吸收能力較差的萃取劑中[14]。
由於微波能極大加速細胞壁的破裂，因而應用於中草葯中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產率。而且由於其選擇性好，提取後基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清[15]。
聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取[18]中對微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進行比較，發現微波輔助提取法所需時間最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超聲輔助法：
其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放並充分與溶劑混合，利於提取[16]。
超聲波輔助法與常規提取法相比，具有提取時間短、產率高、無需加熱等優點[17]。
1.4 索氏提取法：
將植物粉末置於索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃條件下提取至無色（一般為6小時）。過濾，濾渣揮發乾燥完溶媒後加入80%乙醇，再提取6小時，過濾，濾渣乙醇揮發乾燥後加蒸餾水。迴流提取2次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃乾燥，稱重。
1.5 醇提法：
先後將90%和50%乙醇加入植物粉末中，振盪充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至於4℃冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通風乾燥箱中乾燥，再置乾燥皿中恆重保存。
醇提法方法簡單，易於操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法還有稀鹼液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由於稀酸、稀鹼條件下，易使多糖發生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗中避免採用稀鹼液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的純化
2.1 多糖中雜質除去方法 粗多糖中往往混雜著蛋白質、色素、低聚糖等雜質，必須分別除去。
2.1.1 除蛋白質
採用醇沉或其它溶劑沉澱所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質，脫去蛋白質的方法有多種：如選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的酚、三氯甲烷、鞣質等試劑來處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙維積法（Sevag法）[20]：根據蛋白質在氯仿等有機溶劑變性而不溶與水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調為25:5:1或25:4:1，混合物劇烈振搖20到30分鍾，蛋白質與氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然後離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取實驗中要重復處理達三十幾次。並且每次除去蛋白質變性膠狀物時，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質結合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時會沉澱下來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min左右，離心得上面水層，水層繼續用上述方法處理幾次，即得無蛋白質的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點較低，易揮發，不宜大量應用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再繼續混濁為止，在5－10℃放置過夜，離心除去沉澱即得無蛋白質的多糖溶液。此法會引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會像蛋白質那樣沉澱出來。對於對鹼穩定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀鹼溫和處理，可以把這種結合蛋白質分開[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在樣品溶液中加入蛋白質水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，使樣品中的蛋白質降解。通常將其與Sevag法綜合使用除蛋白質效果較好。
2.1.1.5 鹽酸法[23]：取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調節其PH至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉澱，即脫去蛋白質。
另有李知敏[23]和葉將瑜[25]等人分別在植物多糖實驗中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5％、46.1％和42.3％，多糖的損失率分別為15.1%、6.1％和14.3％。鹽酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高;三氯乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脫蛋白效果不及前兩種。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振盪後離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉澱完全，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復多次方可除盡蛋白。
除去蛋白質的樣品用紫外分光光度計檢驗，觀察在280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質已經除盡[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭屬於非極性吸附劑，有著較強的吸附能力，特別適合於水溶性物質的分離。它的來源充足，價格便宜，上柱量大，適用於大量制備性分離。目前用於色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因為活性炭會吸附多糖，造成多糖的損失。
2.1.2.2對於植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱鹼性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素時結合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進行氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時。
2.1.2.4 依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡單，便於操作，多糖損失也較小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。
2.1.2.6發酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一般可不除色素。
2.1.2.7對於動物，微生物等提取得到的多糖也可根據不同情況按上述方法處理。
2.1.3 除低聚糖等小分子雜質
2.1.3.1採用逆向流水透析法。即准備好一桶蒸餾水，用一根導管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導管將水引出，根據水量控制流速，使水緩慢流動48小時。這樣得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液濃度擴散效應，將分子量小的物質如無機鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質。具體的做法是根據多糖溶液的體積截取相應長度的透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面2－3cm處夾緊透析袋，置於一大燒杯中，注入蒸餾水至完全浸沒透析袋後，用磁力攪拌器慢速攪拌，每12小時換一次水，重復3－4次。
2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：
2.2.1 分部沉澱法 根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
2.2.2 鹽析法 在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
2.2.3 季銨鹽沉澱法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來。
2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。
纖維素柱層析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析 最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。
親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質和糖蛋白）做親和色譜來分離多糖。
高壓液相層析
2.2.5 制備性區域電泳 分子大小、形狀及所負電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加於柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負極的），下端為負極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時間為5－12小時。電泳完畢後將玻璃粉載體推出柱外，分割後分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好，但只適合於實驗室小規模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。
2.2.6 金屬絡合物法 常用的絡合劑有費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。
2.2.7 其它方法：純化除採用上述方法外，還有超過濾法（多糖溶液通過各種已知的超過濾膜就能達到分離）、活性炭柱色譜。另據報道，國外多採用的LKB柱色譜系統，用比旋度、示差折射及紫外檢測多糖，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。
2.3 多糖純度的鑒定
2.3.1超離心法 由於微粒在離心力場中移動的速度與微粒的密度、大小和形狀有關，故當將多糖溶液進行密度梯度超離心時，如果是組分均一的多糖，則應呈現單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配製成1％－5％的溶液，然後進行密度超離心，待轉速達到恆定後（通常是60000r/min），採用間隔照明的方法檢測其是否為單峰。
2.3.2高壓電泳法 由於中性多糖導電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，故常將其製成硼酸絡合物進行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡合物就不同，在電場作用下的相對遷移率也會不同，故可用高壓電泳的方法測定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙醯銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強度約為30－50V/cm，時間是30－120min。由於電泳時會產生大量的熱，所以要有冷卻系統，將溫度維持在0℃左右，否則會燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發生的顏色反應在多糖上不明顯，電泳後常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過碘酸希夫試劑等。
2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大於40。
2.3.4旋光測定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉澱。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉澱，比較二次沉澱的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。
2.3.5其它方法：官能團摩爾比恆定法，即如為純品兩次分離所得產物的官能團如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應該恆定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國常用高壓液相法來檢測多糖純度，結果可靠。
必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結果才能肯定。
⑶ 提取基因組的方法
提取基因組DNA和細胞核DNA是不同的方法
提取細胞核要先把細胞破碎分離出細胞核，要在甘油或其他保護劑中進行
SDS十二烷基磺酸鈉：可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離
CATB是一種抽提液，破壞細胞膜的~具體忘了~
DNA不溶於異丙醇，異丙醇可以析出DNA，產生白色絮狀沉澱，用槍頭挑出就可以了
以下是一些具體方法，希望有用
基因組DNA提取方法
制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為後續的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法,鹼裂解法3生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等
試驗步驟：
1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。
2、細胞重懸於冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。
3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。
4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h,
5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相
6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。
7、2500rpm離心10min.轉上清於一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。
2500rpm,離心10min。棄上清。
8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶於適量TE中。
外周血DNA提取技術
分離外周血白細胞提取方法：
試驗步驟：
1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。
2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。
3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。
4、2500rpm離心10min，棄上清。
5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。
6、3000rpm離心10min，棄上清。
7、倒置離心管，去掉殘液。
8、得白細胞，－80?C凍存。
試驗要求：
血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。
氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA：
試驗試劑：
Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最後加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。
ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最後加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。
提取緩沖液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最後加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌
試驗步驟：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。
2、沉澱中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。
3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置於37℃，水溶1h。
4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。
5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。
6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。
7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。
8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃乾燥。
10、加入50μl滅菌去離子水，轉彈，混勻。
NaI提取法提取外周血白細胞基因組：
實驗步驟：
1、取外周抗凝血（全血）100ul於eppendorf管中，12000rpm離心12min。
2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。
3、混勻後加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。
4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。
5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置後的反應體系15000rpm離心12min，使沉澱緊貼eppendorf管壁。
6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。
7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘乾（37℃恆溫箱）後，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。
常用的外周血白細胞基因提取方法：
試驗原理：
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑，反復抽提，使蛋白質變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶於水，不溶於有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，並在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞，變性沉澱。離心後有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在於上層水相中，蛋白質則沉澱於兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質。氯仿的作用是有助於水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提後的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉澱DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉澱中的鹽，真空乾燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。
試驗步驟：
1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液於室溫解凍後移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉澱，37℃水浴溫育1h。
2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h後，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉動幾次，混勻反應液。
3、反應液冷卻至室溫後，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），上下轉動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。
4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色雲絮狀DNA出現。用玻璃棒小心挑取雲絮狀的DNA，轉入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復一次。室溫揮發殘留的乙醇，但不要讓DNA完全乾燥。加TE液20ul溶解DNA,置於搖床平台緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。
真核細胞DNA的制備
一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是採用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切後可用於Southern分析，還可用於PCR的模板、文庫構建等實驗。
根據材料來源不同，採取不同的材料處理方法，而後的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：
1、防止和抑制DNase對DNA的降解。
2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。
試劑准備：
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。
3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、無水乙醇、75%乙醇
試驗步驟：
材料處理：
1、新鮮或冰凍組織處理：
1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉移到勻漿器中勻漿。
2)將勻漿液轉移到1.5ml離心管中。
3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。
4)60°C水浴1-3hr。
2、培養細胞處理：
1)將培養細胞懸浮後，用TBS洗滌一次。
2)離心4000g×5min，去除上清液。
3)加10倍體積的裂解緩沖液。
4)50-55°C水浴1-2hr。
DNA提取：
1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。
2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。
3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數次。
5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。
7、待絮狀物出現後，離心5000g×5min，棄上清液。
8、沉澱用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。
9、室溫下揮發乙醇，待沉澱將近透明後加50-100mlTE溶解過夜。
植物組織中DNA的提取
試驗原理：
脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在於細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質結合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶於0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶於0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質沉澱而除去，得到的是含有核酸的上清液。然後用95％的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質的提取液中沉澱出來。
植物DNA的SDS提取法：
試驗試劑：
1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解後合並為一，用0.2mol/L的NaOH調至pH7.0，並定容至1000ml。
2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。
3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。
4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。
5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配製成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。
6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。
8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然後在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之後即將濾液放入冰箱，待結晶出現再置室溫下涼干待用。
9、1mol／LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。
12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。
13、0.05mol/LNaOH。
14、DNA標准液：取標准DNA25mg溶於少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，後用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻後用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標准溶液。
實驗步驟：
1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預冷研磨緩沖液並加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。
2、將勻漿無損轉入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振盪30s，轉入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質。以4000rpm離心5min。
3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質及下層的氯仿。
4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然後迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液〔提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。
5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振盪1min，靜置後在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。
6、用滴管吸95％的預冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉澱纏繞在玻璃棒上。
7、然後加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。
8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗製品。
9、加入已處理的Rnase溶液，使其最後的作用濃度為50～70μg/ml，並在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。
10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振盪1min，再除去殘留蛋白質及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。
11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。
植物DNA的CTAB提取法：
試驗步驟：
1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。
2、將粉末轉移到加有7ml經預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻後置於65℃水浴中，溫育30min。
3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉離心20min。
4、將上清轉移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。
5、轉移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉澱緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉澱。1000rpm離心10min，使DNA沉澱於管底。
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置於56℃水浴中過夜。
7、待DNA完全溶解後，加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉澱，挑出DNA，置於15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。
8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作台上吹乾。
9、將風乾的DNA直接在4℃保存備用或溶於100μlTE溶液中於-20℃保存。
細菌DNA的提取方法
針對一些不易於提取的細菌的方法:
試驗試劑：
抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)
25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water（抑制RNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
試驗步驟：
1、抽提緩沖液65℃預熱。
2、加菌體到已經預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。
3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振盪，以12,000rpm，離心10min。
4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振盪，以12,000rpm，離心10min。
5、重復再作一次步驟4。
6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉澱。
7、以2,000rpm，離心10min。
8、棄上清，以70％乙醇條洗沉澱，也可以再用100％乙醇洗，然後溶解於100ml水中。
較為常用的細菌DNA提取方法：
實驗步驟：
1、將菌株接種於液體LB培養基，37℃震盪培養過夜。
2、取1.5ml培養物12000rpm離心2min。
3、沉澱中加入567ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，於37℃溫育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻後再65℃溫育10min。
5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉入一隻新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉澱下來，沉澱可稍加離心。
6、沉澱用1ml的70%乙醇洗滌後，離心棄乙醇．
真菌DNA提取總結的兩種方法：
第一種方法：
試驗步驟：
1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入4mL提取液，快速振盪混勻。
3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。
4、以4℃，1000rpm，離心5min。
5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。
6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉澱,混勻,靜置約30min。
7、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。
8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。
9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。
10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。
11、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。
DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。
第二種方法：
試驗步驟：
1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入3mL65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振盪混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。
3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。
4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。
5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30min。
6、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。
7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。
8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。
9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。
10、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。
植物基因組提取(CATB法)
作者： 時間：2008-05-13 14:26:27 來源: 生物谷 瀏覽評論
一、實驗目的
掌握植物總DNA的抽提方法和基本原理。學習根據不同的植物和實驗要求設計和改良植物總DNA抽提方法。
二、實驗原理
通常採用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由於植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易於破碎，並減少研磨過程中各種酶類的作用。
十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，並使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心後即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉澱，沉澱DNA溶於TE溶液中，即得植物總DNA溶液。
三、實驗材料
水稻幼葉
四、主要配方
2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, 冷卻後0.2-1% 2-巰基乙醇 （400ul） 氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。
五、實驗步驟
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱。
（2）取少量葉片（約1g）置於研缽中，用液氮磨至粉狀；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；
（4） 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌中，磨碎液的高度約占管的三分之二；
（5）置於65℃的水浴槽或恆溫箱中，每隔10 min輕輕搖動，40 min後取出；
（6）冷卻2 min後，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振盪2~3 min，使兩者混合均勻；
（7）放入離心機中10 000 rpm離心10 min，與此同時，將600 µl的異丙醇加入另一新的滅菌中；
（8） 10 000 rpm離心1 min後，移液器輕輕地吸取上清夜，轉入含有異丙醇的內，將離心管慢慢上下搖動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；
（9）10000 rpm離心1 min後，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉澱倒出，將離心管倒立於鋪開的紙巾上； （10）60 sec後，直立離心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸鈉，輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉澱與管底的DNA塊狀物浮游於液體中；
（11）放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
（12）10000 rpm離心1 min後，倒掉液體，再加入800 µl 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm離心30 sec後，立即倒掉液體，將離心管倒立於鋪開的紙巾上；數分鍾後，直立離心管，乾燥DNA（自然風干或用風筒吹乾）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置於37℃恆溫箱約15 h，使RNA消解；
（15）置於-20℃保存、備用。
2. DNA質量檢測
瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。
六、 注意事項
（1）葉片磨得越細越好。
（2）移液器的使用。
（3）由於植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。
⑷ 弱酸性陽離子交換樹脂在何種水質條件下可以去除鈉離子
在什麼條件下也不能去除鈉離子啊
這種樹脂一般是用來去除碳酸根 碳酸氫根及其他鹼性鹽類或用作胰凝蛋白酶、細胞色素C、慶大黴素、激素(垂體)、胰島素、溶菌霉、新鏈黴素等生化葯物的分離提純。。
⑸ 雜合超過5% 可以按照兩套基因組處理嗎
提取基因組DNA和細胞核DNA是不同的方法
提取細胞核要先把細胞破碎分離出細胞核,要在甘油或其他保護劑中進行
SDS十二烷基磺酸鈉：可破壞細胞膜、核膜,並使組織蛋白與DNA分離
CATB是一種抽提液,破壞細胞膜的~具體忘了~
DNA不溶於異丙醇,異丙醇可以析出DNA,產生白色絮狀沉澱,用槍頭挑出就可以了
以下是一些具體方法,希望有用
基因組DNA提取方法
制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟,通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb.在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為後續的實驗打下基礎.主要是CTAB方法,其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法.2化學方式：異硫氰酸胍法,鹼裂解法3生物方式:酶法.根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等
試驗步驟：
1、貼壁細胞用胰酶消化,離心收集.
2、細胞重懸於冰冷的PBS漂洗一次,離心收集.試驗步驟2再重新作一邊.
3、加入5mlDNA提取緩沖液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻.
4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻,50℃水浴3h,
5、用等體積的酚抽提一次,2500rpm離心收集水相,用等體積的（酚,氯仿,異戊醇）混合物抽提一次,2500r/min離心收集水相
6、用等體積的氯仿,異戊醇抽提一次.加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻,冰浴,10min..
7、2500rpm離心10min.轉上清於一離心管中.加入等體積的異丙醇.室溫10min.
2500rpm,離心10min.棄上清.
8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇.-20℃20min.
9、12000r/min,室溫離心5min.棄上清.將DNA溶於適量TE中.
外周血DNA提取技術
分離外周血白細胞提取方法：
試驗步驟：
1、取人肘靜脈血5ml,EDTA抗凝,2500rpm離心10min.
2、小心吸取上層血漿,分裝到3個0.5ml離心管中.
3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液,搖勻,冰浴15min.
4、2500rpm離心10min,棄上清.
5、加入10ml溶血液,搖勻,冰浴15min.
6、3000rpm離心10min,棄上清.
7、倒置離心管,去掉殘液.
8、得白細胞,－80?C凍存.
試驗要求：
血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h,4℃放置不超過5h,以防白細胞自溶.
氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA：
試驗試劑：
Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最後加滅菌去離子水至1000ml,高壓滅菌.
ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最後加滅菌去離子水至350ml,高壓滅菌.
提取緩沖液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最後加滅菌去離子水至100ml,高壓滅菌
試驗步驟：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分顛混至清亮.以4000rpm,離心5min.棄上清液.
2、沉澱中加入ligsisbuffer1500μl,充分勻漿.以6000rpm,離心5min.
3、徹底棄去上清,加入extractionbuffer500μl（裂解細胞）,混勻置於37℃,水溶1h.
4、加入8μl的蛋白酶K,顛混,37℃過夜（或55℃,3h,但是37℃效果要好些）.
5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min,以5500rpm,離心15min.
6、取上清,每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇,搖勻10min,以5500rpm,離心15min.
7、取上清,每管加入500μl氯仿－異戊醇,搖勻10min,以5500rpm,離心15min.
8、取上清,每管加50μl的3M的NaAC＋,適量無水乙醇（預冷）至滿,搖勻放入-20℃保存2h以上.
9、以12000rpm,離心20min.去上清,加入70％乙醇500μl,以12000rpm,離心5min,去上清,50－60℃乾燥.
10、加入50μl滅菌去離子水,轉彈,混勻.
NaI提取法提取外周血白細胞基因組：
實驗步驟：
1、取外周抗凝血（全血）100ul於eppendorf管中,12000rpm離心12min.
⑹ 氨基酸序列分析問題：已知一個七肽的組成為:gly,phe（2），tyr，met，asp，用胰凝乳蛋白酶水解
（2）是啥意思？
⑺ 細菌基因組的提取原理
一、實驗原理
真核生物的一切有核細胞（包括培養細胞）都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在於細胞核內，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉澱使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿後提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可將 蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恆溫水浴鍋、台式離心機、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）
2. 試劑：
（1）細胞裂解緩沖液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶於1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃備用。
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。
（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、
（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
三、操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置於玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恆溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振盪離心管數次。於台式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉混勻後，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）
3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振盪混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振盪混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻後室溫沉澱2min ，離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置於吸水紙上，將附於管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉澱物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置於吸水紙上，將附於管壁的殘余液滴除掉，室溫乾燥。
9.加200ul TE重新溶解沉澱物，然後置於4℃或?C20℃保存備用。
10.吸取適量樣品於GeneQuant上檢測濃度和純度。
四、常見問題
1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。
2.在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不純，含雜質較多；加溶解液太少使濃度過大。沉澱物太乾燥，也將使溶解變得很困難。
4. 電泳檢測時DNA成塗布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小於1.8；不純，含有蛋白質等雜質。在這種情況下，應加入SDS至終濃度為0.5%，並重復步驟2～8。
6.酚/氯仿/異戊醇抽提後，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。
基因組DNA提取方法2008-10-23 18:43制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為後續的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法超聲波法研磨法凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法鹼裂解法3生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等
試驗步驟：
1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。
2、細胞重懸於冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。
3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混勻。
4、加入25ul蛋白酶K使終濃度達到100ug/ml混勻，50℃水浴3h
5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相
6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL混勻，冰浴，10min.。
7、2500rpm離心10min.轉上清於一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。
2500rpm離心10min。棄上清。
8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min室溫離心5min。棄上清。將DNA溶於適量TE中。
外周血DNA提取技術
分離外周血白細胞提取方法：
試驗步驟：
1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。
2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。
3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。
4、2500rpm離心10min，棄上清。
5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。
6、3000rpm離心10min，棄上清。
7、倒置離心管，去掉殘液。
8、得白細胞，－80?C凍存。
試驗要求：
血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。
⑻ 用洗脫曲線說明ASP和lys的出峰次數並解釋
應該是出峰順序吧，先是Asp再Lys。陽離子交換樹脂，Asp在pH5.3中帶負電被排斥先洗出，Lys帶正電與樹脂交換。
⑼ 要測胰蛋白酶活，可是植物胰蛋白酶怎麼制備啊
反膠束萃取制備胰蛋白酶
胰蛋白酶（EC 3 . 4 . 4 . 4 ）是從豬、牛等哺乳動物胰臟提取的一種以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，可提高組織、血管的通透性、液化血塊、血膿纖維及壞死組織等，用於治療炎症、潰瘍、創傷等引起的膿腫及支氣管炎、肺氣腫等。
( 1 ）工藝流程
( 2 ）主要步驟
① 制備粗酶液 稱取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性為25 . 7U /mg，胰澱粉酶活性為18.4U/mg，胰脂肪酶活性為63.7U/mg。將其用pH 值為5 . 25 、濃度為0．2mol / L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，然後進行真空過濾，收集濾液並用磷酸緩沖液進行稀釋，使胰蛋白酶活性為3-10U / mg ，備用。
② 制備反膠束 將AOT置於100 ℃ 烘箱中乾燥至恆重，放入乾燥器中冷卻至室溫。然後稱取44.4369 置於配製罐中，加入10L異辛烷，在攪拌下使其形成均勻的分散液，再加入定量蒸餾水，在200r/min的轉速下處理2h ，獲得濃度為0 .lmol / L 的透明AOT-異辛烷反膠束溶液。使用時用異辛烷稀釋10 倍。
③ 萃取 將稀釋10 倍的AOT-異辛烷反膠束置於萃取器中，按照AOT 異辛烷反膠束：粗酶溶液體積比為（2 -3 ) : 1 的比例加入粗酶溶液萃取3 - 4 次，，在300 - 400r / min 的轉速下萃取5 -10min 。如此每次萃取完成後，均進行離心分離，離心機轉速為4000 - 6000r / min ，時間10 -15min 收集、合並離心上層清液，進行反萃取，下層萃余液用於制備胰脂肪酶。
④ 反萃取 將荷載胰蛋白酶的AOT -異辛烷反膠束置於萃取器中，在攪拌下加入等體積的反萃取液進行反萃取15 -20min 萃取液為0．02 -0.05mol / L 的NaCI 溶液。如此反萃取3 次，每次萃取完成後，均進行離心分離，離心機轉速為4000 -6000r / min,時間為15 -20min 。分別收集、合並離心上層清液和下層反萃取液，前者再生後可再次萃取胰蛋白酶，後者進行超濾濃縮。
⑤ 脫鹽、濃縮 將反萃取液置於截留分子量2 萬的超濾膜中，在0 . 1 ～0.2MPa 的壓力下進行脫鹽及濃縮處理，直至處理液體積降低至原液體積的1 / 5 左右時停止，獲得脫鹽濃縮液。
⑥ 乾燥 將濃縮液置於凍干瓶中，在-60～-50 ℃ 、真空度為25～5OMPa 的條件下乾燥24h ，獲得純化胰蛋白酶凍乾粉。
( 3 ）主要指標
淺黃色粉末，胰蛋白酶的總萃取率為74 . 2 % ，胰蛋白酶活性為3145 . 3U/ mg ，純化45 . 16 倍；胰澱粉酶活性為0 . 58U / mg ，降低4 . 66 倍；無脂肪酶活性。
實例234 豬胰中分離核糖核酸酶A、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和激肚釋放酶
採用提取、鹽析、反膠束、離子交換、凝膠分子篩層析等技術，可從豬胰臟中同時獲得核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激膚釋放酶，有顯著的經濟效益。
( 1 ）用該方法同時制備上述四種酶的工藝流程
( 2 ）主要步驟
① 提取、鹽析 取0.5kg 豬胰，除脂肪及結締組織後絞碎，加入其3 倍質量的乙酸提取液攪拌提取24h 。提取液溫度為4 ℃ ，pH 值為4 . 0 ，硫酸濃度為0．125mol / L 。提取完成後用4 層紗布過濾，收集濾過液約1250-1300mL ，在攪拌下加入約750g 固體硫酸錢溶解，使溶液達到75 ％飽和度。4000r / min 轉速離心15min , 分別收集上層清液（約1500mL ）和鹽析沉澱物（約40 -45g ）。
② 制備核糖核酸酶A 取收集的上層清液，在攪拌下加入固體硫酸銨溶解，使溶液達到85 ％飽和度。4 000r / min 轉速離心15min ，棄清液。將沉澱溶於等體積蒸餾水，用10 ％乙酸鈉調節pH 值為6 . 0 ，上用濃度為0 .0lmol / L 、pH6 .0磷酸緩沖液（PBS ) 平衡過的CM - SepharoseFF 柱，CM - SepharoseFF 用量與上柱液體積之比為1 : 5 ( g / mL ）。接著用2 倍樹脂床體積的上述平衡緩沖液洗滌荷載核糖核酸酶A 的CM -SepharoseFF 色譜柱後，分別用0．01mol / L 、pH6 ．0和0．lmol / L 、pH7 . 5 磷酸緩沖液進行梯度洗脫，收集活性峰液，調節其pH 值為8 . 0 ，上用0．05mol / L 、pH 8 . 0 磷酸緩沖液平衡的Sephacryls -200 柱，Sephacryls -200 用量與上柱液體積之比為1 : 5 （g/mL ）。然後用同樣的緩沖液梯度洗脫，收集活性峰液，進行透析、脫鹽、凍干，獲得核糖核酸酶A 凍乾粉。
③ 制備胰蛋白酶取75 ％飽和度的硫酸錢鹽析沉澱，用10 倍蒸餾水溶解，加入鹽析沉澱質量30 ％的CaCI ：粉末，調節pH 值為8 . 0 ，再加入5 ～ 10mg 粗胰蛋白酶，於4 ℃ 下激活24h 。過濾除去硫酸鈣沉澱，調節濾液pH 值為7 . 8 ，加入定量對氨基苯甲脒－sepharose6B ，攪拌下吸附lh ，紗布過濾，收集濾液用於分離其他酶。將吸附胰蛋白酶的對氨基苯甲眯一S 叩harose6B 樹脂用pH 值為7 . 8 、濃度為0 . lmol / L Tris 一0 .05mol / L HCI 的緩沖液（含0 . lmol / L CaC12 ）抽濾洗滌，緩沖液用量為樹脂體積的2 倍。洗滌完成後將樹脂裝柱，用其1 倍體積的相同緩沖液平衡。再用20 倍樹脂體積的0 . lmol / L 甲酸-0 . 05mol / L KCI 緩沖液洗脫，洗脫液pH 值為2 . 2 ，洗脫流速為2 ～3 倍樹脂體積／h 。收集洗脫活性峰進行透析，凍干，獲得胰蛋白酶。
④ 彈性蛋白酶制備取未被對氨基苯甲脒-Sepharose6B 吸附的濾液，對水透析至透析管內產生沉澱時止。用400Or / min 的轉速離心15min ，收集上層清液用於制備彈性蛋白酶。沉澱用5 ～ 6 倍體積的Tris-HCI 緩沖液溶解，該緩沖液濃度為0．02mol / L 、pH 值為8 . 8 。將溶解液用稀NaOH 調節pH 值為10 . 4 ，上用上述緩沖液平衡好的DEAE －纖維素柱，溶解液與DEAE -纖維素的比為（5 ～6 ) ： 1 ( mL / g ）。上柱完成後再用同樣的緩沖液以2 ～3 倍樹脂體積／h 的流速洗滌，緩沖液用量為1 倍樹脂體積。彈性蛋白酶在此條件下不被交換，收集洗滌活性峰，對水透析，凍干，即得彈性蛋白酶。比活力2010U / mg ，活力回收10 ％。
⑤ α-糜蛋白酶制備 將制備彈性蛋白酶時的離心清液用乙酸鈉調節pH 值為5 ．0，上用0 . lmol / L 、pH 5 . 0 檸檬酸緩沖液平衡的S- SepharoseFF 柱。用2 倍柱體積的、同樣緩沖液以3mL / min 洗滌樹脂，收集洗滌液待制備激膚釋放酶。用300mL 0 . 01～0.05mol / L 、pH5.0檸檬酸緩沖液梯度洗脫，收集活性峰組分( 160 ～200mL ) ，透析，凍干，即得α-糜蛋白酶。
⑥ 胰糜蛋白酶制備 取制備彈性蛋白酶時的離心上層清液，用乙酸鈉調節pH 值為3 . 5～ 4 . 0 ，加入等體積0.lmol / L AOT 反膠束，在200r /min 攪拌下萃取5min , 4000r / min 離心5min 。收集上層有機相，萃余液再用等體積0.lmol / L AOT 反膠束重復萃取2 次。合並有機相，加入等體積、含lmol / L KCI 、pH8.0的0.02mol / L 碳酸鹽緩沖液，在200r /min 攪拌下反萃取5min , 60 00r/min 離心5min ，收集下層水相，萃余液同法反萃取2 次。合並反萃取液，對水透析脫鹽，凍干，得胰糜蛋白酶。
⑦ 激肽釋放酶制備 取用0.01mol/ L 、pH 5.0檸檬酸緩沖液洗滌S-SepharoseFF 柱的洗滌液，用檸檬酸調節pH 值為4 . 5 ，按洗滌液：丙酮=1：0.35 的比例加入丙酮，於-4 ℃ 冰箱中放置2h , 過濾。濾液中加入乙酸鈉和NaCI ，使其濃度分別達到0.O65mol / L 和0.035mol / L 。繼續加入丙酮，使體積比達到65 ％。抽濾，濾餅用少量蒸餾水溶解，用稀乙酸調節pH 值為4 . 2 ，再次產生沉澱。抽濾，濾餅用少量蒸餾水溶解後用稀乙酸鈉調節pH 值為6 . 8 ，對水透析脫鹽後上用濃度為0.1mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液平衡的輕基磷灰石柱，上柱液與經基磷灰石的比為（5 ～ 6 )：l ( mL / g ）。用0 . 01 ～0.2mol/L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液以1～ 1 . 5 倍樹脂柱體積／h 進行梯度洗脫，洗脫液用量約為上柱液體積的1～1 . 5 倍。收集活性峰組分，對水透析脫鹽後加到經過重新平衡的另一羥基磷灰石柱上，改用0.05 ～0.2mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液進行梯度洗脫。收集活性峰組分，再次對水透析脫鹽後，凍干，獲得激肽釋放酶。
( 3 ）主要指標
核糖核酸酶A 的活力回收≥75 。％，比活力為71000U/mg；胰蛋白酶的活力回收≥60 % ，比活力為23750U / mg ；彈性蛋白酶的活力回收≥10 % ，比活力為2010 U / mg ；胰糜蛋白酶活力回收≥70 % ，比活力為150U / mg ；胰激膚釋放酶活力回收≥6 % ，比活力為130U / mg 。