⑴ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性
因為抄離子交換吸附蛋白質並不是特異性吸附，在某些情況下可能難以判斷結合的蛋白質是否為當初設計的目的蛋白。
離子交換吸附依賴於蛋白質表面的靜電荷，如果蛋白質結構比較特殊，可能會有在各種pH都難以結合上離子交換層析的情況。
離子交換層析對於等電點與目標蛋白接近的雜蛋白並沒有很好的分離效果。
⑵ 如何消除非蛋白質的含N物質的影響
下面的實驗五可以：其餘的可能對你也有用，遂沒刪
實驗一多酚氧化酶（PPO）的分離提取
一、原理與目的
多酚氧化酶是植物組織內廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機械損傷和病菌侵染後，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質對微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質出現是植物防止傷口感染的愈傷反應，因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內其他底物氧化相偶聯，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養喪失的主要原因之一。PPO氧化內源的酚類物質生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質、氨基酸等作用生成高分子絡合物而導致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。
本實驗將採用馬鈴薯為主要材料，通過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉澱、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。
通過本項實驗，學習和了解蛋白質的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關儀器設備的操作使用，以及蛋白質的提取、分離的系統技術。
二、材料與試劑
（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）
（2）試劑：
0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配製時配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時配
（3）實驗器械與儀器設備：
試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；
過濾紗布；植物組織勻漿器；pH計和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機；
DL-7A大容量低速冷凍離心機
三、操作步驟
1：粗酶提取：
水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層後紗布過濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉澱獲得酶提取液。
2：鹽析分級沉澱：
在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），然後6000rpm離心20min棄除沉澱；離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉澱。
四、實驗結果
獲得PPO粗酶液。
實驗二 PPO粗酶液的純化
一、原理
1.葡聚糖凝膠Sephadex G-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最後流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）
2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。後用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到純化。
二、材料與試劑
試劑：0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4(內含0.001M EDTA)配製時配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠Sephadex G-200;蘭葡萄糖－40、70、100等；
實驗器械與儀器設備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恆流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機
三、操作步驟
1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡
（1）柱材處理
稱取一定量的Sephadex G-200乾粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現為止。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產生氣泡，影響蛋白質分離速度，濃度過低易產生凝膠分層，影響蛋白質的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內徑相等的濾紙片覆蓋於凝膠上。層析柱上端進液口連接恆流泵，下出液口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恆流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝膠。
2．上樣：將粗酶液上柱。
3．洗脫：用0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4（內含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質濃度、聚丙烯醯胺凝膠電泳分子量的基本性質分析測定。
4．DEAE－纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實驗採用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑乾粉浸泡於蒸餾水中，去除雜質；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，並將其在抽濾漏斗中抽干；將抽乾的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恆流泵，下出口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恆流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001M EDTA)，預先將DE-52柱進行平衡。
5．上樣：
將洗脫酶液上樣，用0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4（內含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。
6．洗脫：
用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4(內含0.001M EDTA)進行梯度洗脫。
7．測定酶活性和蛋白質濃度
實驗三 PPO活性測定
一、原理與方法
PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實驗是採用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應體系的OD值產生變化，通過OD值上升的讀數變化確定PPO的酶活大小。
其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恆溫水浴中預熱後加入0.05ml酶液，反應5分鍾，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數，以每分鍾增加0.01O.D.值定義為一個酶活性單位（U）。
二、儀器與試劑
（1）樣品：
多酚氧化酶粗酶液
硫酸銨沉澱組分
DE-52洗脫組分
葡聚糖凝膠洗脫組分
（2）底物：
鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液
（3）反應體系：
0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8
（4）器皿與儀器：
試管、恆溫水浴等
分光光度計
三、酶蛋白的比活性
比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質
四、實驗結果與分析
1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）
結果列表
試管號 蛋白質濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.16 0.09
粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03
1 0.00 0.01 5 0.03 0.01
2 0.13 0.09 6 0.02 0.02
分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進行下一步純化。
2. DE-52的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）
結果列表
試管號 蛋白質濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.03 0.05
粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05
1 0.00 0.00 5 0.07 0.02
2 0.03 0.02 6 0.03 0.00
分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白。
實驗四胰酶分離提取
一、原理與目的
提取制備酶的經典方法，多採用硫酸銨分級沉澱，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉澱，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉澱而除去。經此多次提取，最後在PH8.0硼酸緩沖液中得到結晶。
胰酶在PH3.0時最穩定，可在低溫下儲存較長的時間而不失活；低與此PH酶易變性；高於PH5時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應在低溫和低PH下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在於動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的一個肽鏈被斷裂，丟失一個6肽，分子構象發生改變，PI變成10.8。
本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結晶的操作技術。同時為親和層析、免疫學實驗准備實驗樣品。
二、材料與試劑
1．儀器
紫外光分光光度計、恆溫水浴、離心機、組織搗碎機、PH計、顯微鏡、秒錶、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。
2．材料：新鮮豬胰臟
3．試劑及溶液配製
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。
0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合後用PH計校正。
三、操作步驟
1．胰蛋白酶原的提取與分離：
（1）稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結締組織，在低溫下用絞肉機絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機搗碎）加1－2倍體積以預冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取（按1g組織相當於1ml體積計算，以此類推）。檢查提取液中PH，若高於PH3.0時應及時用10％乙酸調節，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而後用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘渣一次（時間約為1－2h），合並濾液，此時濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調整PH至2.5－3.0，放置 3－5h後，渾濁濾液冷卻後，用玻璃漏斗進行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉澱物。
(2)鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經壓干後稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗製品。
（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗製品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用於測定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。
（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積後，用5M硫酸溶液調節濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉澱，濾液體積約1000ml，加入已經研細的硫酸銨粉末，使其溶液達40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉澱。
實驗五卵清蛋白分離提取
一、實驗目的與原理
雞卵粘蛋白存在於雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑製作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩定的，而在鹼性溶液中較不穩定。
由於雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑製作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基配製純化胰酶的親和材料。
二、材料與試劑：
1．材料：新鮮雞蛋2隻
2：儀器：抽濾瓶500－1000ml、燒結漏斗、移液器、磁力攪拌器
3：試劑：
10％TCA，用固體NaOH調調PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml
pH8.0,0.1M Tris-HCL緩沖液
三、操作步驟
1，取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置於燒杯中，外用溫水浴25℃－30℃，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出現大量白色絮狀沉澱，加完後最終PH約3.5，再繼續攪拌30min，然後在4℃冰箱中放置過夜。
2,次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。
3，邊攪拌邊加入4℃預冷的丙酮200ml沉澱蛋白，在4℃放置2h之後將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉澱部分於4000rpm離心5min，收集沉澱。
4，將沉澱溶於10ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4h，換水兩次，再對碳酸鈉緩沖液透析過夜，4000rpm離心10min ,去除不溶物。
實驗六親和層析純化胰酶
一、實驗目的與原理
生物大分子化合物的重要特徵之一是具有與某些相對應的分子通過次級鍵或共價鍵專一結合的能力即親和力。例如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結合的雙方不僅是專一的，而且結合以後可以在不喪失生物活性的基礎上用物理或化學的方法進行解離。根據這一特性，如果把具有親和力的一對分子的某一方連接於水不溶的固體載體上作為固定相，那麼另一方隨著流動相流經該固定相的時候，雙方便親和結合為一個整體。然後只有改變某種物理條件或化學條件使結合的雙方解離，即能得到於固定相有特異親和力的某一特定物質。這種利用生物分子和相對應分子之間親和結合和解離性質而建立起來的層析方法稱之為親和層析。
本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑－雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯及親和層析操作的基本過程和技術。
二、儀器與試劑
1.雞卵粘蛋白制備
2．Sephadex-G75的活化和偶聯
2．5g乾重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶於20ml水）
3．親和層析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml
儀器器材：抽濾瓶500－1000ml、層析柱、紫外分光光度計、紫外蛋白檢測儀、燒杯漏斗、移液管、磁力攪拌器
三、操作步驟
1、雞卵粘蛋白的制備
2、Sephadex-G75的活化及偶聯
2.5g乾重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數次，緩慢攪拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數次，抽干備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶於35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75％K2CO3，調pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應過程隨時加入5％K2CO3,以維持pH的穩定。0.27gKBH4 溶於20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。
3、胰蛋白酶的親和層析
卵類粘蛋白在pH7－8的條件下能與胰蛋白酶專一地結合，而在pH2－3時又能解離，因而掌握好上柱地PH條件和洗脫緩沖條件，便可將胰蛋白酶從含雜蛋白地粗酶液中選擇性地結合於柱上，待洗去不結合或非專一性結合地雜蛋白後，改變PH值便可將胰蛋白酶洗脫下來。從而達到純化地目的。由於親和層析結合地專一性，上柱體積可以比較大，得到濃縮的提純產品。
(1)親和層析
將雞卵粘蛋白－Sephadex-G75裝柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩沖液平衡，平衡約2－3倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監測儀280nm處檢測蛋白質吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩沖液沖洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線後，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，測總蛋白量及比活性，並根據上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經親和層析後胰蛋白酶比活性提高的倍數，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。
當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線後，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復使用。
（2）胰酶蛋白和活性測定
實驗七 SDS-PAGE測定蛋白質分子量及蛋白質的純度鑒定
一、實驗目的與原理
蛋白質在聚丙烯醯胺凝膠中電泳時，它的遷移取決於它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發現，如果在聚丙烯醯胺系統中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS),大多數蛋白質能與SDS按一定比例結合，即每克蛋白質結合1.4g的SDS－復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質原有的電荷差別，使蛋白質分子電泳的遷移率主要取決於本身的分子量，而與蛋白質所帶的電荷無關，在一定條件下，蛋白質的分子量的對數與電泳遷移率間呈負相關。
本實驗的目的是對多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測定，通過實驗，學習和掌握SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法蛋白質純度和分子量的鑒定。
二、儀器與試劑
1．材料：
硫酸銨鹽析沉澱的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。
2．試劑：
（1）丙稀醯胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis）
（2）10％的SDS溶液
（3）10％的過硫酸銨溶液
（4）四甲基乙二胺（TEMED）
（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris,PH8.8
（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris,PH6.8
（7）電極緩沖液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3
（8）樣品緩沖液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭
（9）染色液：0.15％考馬斯亮藍R250，溶於脫色液
（10）脫色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液
（11）標準分子量蛋白。
3．儀器設備：
電泳儀，垂直電泳槽等。
三、操作步驟
1, 凝膠制備：
用兩塊電泳玻璃板製成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配製好的分離膠溶液，倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集後，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。
2, 上樣：
分別取樣品若干ml於離心管中，按1/1-1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3－5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過30ul不同濃度的標准蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結束後，調節電泳儀電流到10mA（2－3mA/em），保持電流穩定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底1－2cm時，即可停止電泳。
3, 染色：
電泳完畢後，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，24h後，即可看到清晰的蛋白質條帶。
四、結果 （略）
五、注意事項
1、 SDS與蛋白質的結合按質量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質），如果比例不當，就不能得到准確的數據。
2、用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質相對分子量時，必須同時作標准曲線。不能利用這次的標准曲線作為下次用。
3、有些蛋白質由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對於這一類蛋白質，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。
4、有的蛋白質（如：電荷異常或結構異常的蛋白質；帶有較大輔基的蛋白質）不能採用該法測相對分子量。
5、如果該電泳中出現拖尾、染色帶的背景不清晰等現象，可能是SDS不純引起。
等電聚焦電泳（IEF）分離蛋白及測定蛋白質等電點
一、原理
等電點聚焦（IEF）是在電場中分離蛋白質技術的一個重要發展，等電聚焦是在穩定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。
在電場中充有兩性載體和抗對流介質，當加上電場後，由於兩性載體移動的結果，在兩極間逐步建立穩定的pH梯度，當蛋白質分子或其他兩性分子存在於這樣的pH梯度中時，這種分子便會由於其表面電荷在此電場中運動，並最終達到一個使其表面靜電荷為0的區帶，這時的pH則是該分子的pI，聚焦在等電點的分子也會不斷擴散，一旦偏離其等電點後，由於pH環境的改變，分子又立即得到正電荷或負電荷，從而又向pI遷移。因此，這些分子總會是處於不斷擴散和抗擴散的平衡中，在pI處得以「聚焦」.
二、儀器與試劑
1．材料：蛋白樣品
2．試劑：
聚丙烯醯胺、甲乙聚丙烯醯胺、兩性電解質、尿素、NP-40、teiton-100
電極液：1M磷酸（陽極液）、1M氫氧化鈉（陰極液）
固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶於500ml，定容為1000ml
染色液：0.35g考馬斯亮藍R－150溶於300ml脫色液中，加熱到60－70℃，加入0.3g硫酸銅。
脫色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶於水
樣品緩沖液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素
三、操作步驟：
1, 樣品制備：
用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應透析後，冷凍乾燥、再復溶於IEF樣品緩沖液。充分溶解後，離心去除不溶雜質。
2,制模具：
洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅化面相對，放上夾條，夾子夾好。
3, 配膠：
膠液組成：6ml膠母液（10％，19/1）
6－8％尿素
1ml Ampholine (pH3.5-10)
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, 灌膠：配好的膠迅速灌入模具
5, 電泳：
等膠凝固後，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦乾，小心放於電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，橫功率25W電泳，約10min後，暫停電泳，取下紙片，繼續電泳約30min，待電流達4mA以下，停止電泳。
6, 表面電極測定蛋白質的pI
7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min
8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現
9, 可脫色至背景消除後乾燥保存。
四、結果 （略）
五、注意事項
1、兩性電解質是等電聚焦的關鍵試劑，它的含量2％-3％較合適，能形成較好的pH梯度。
2、 丙烯醯胺最好是經過重結晶的。
3、 過硫酸銨一定要新配置。
4、 所有水用重蒸水。
5、樣品必須無離子，否則電泳時樣品帶可能走歪，拖帶或根本不成帶。
6、 平板等電聚焦電泳的膠很薄，當電流穩定在8mA，電壓上升到550V 以上，由於陰極飄移，造成局部電流過大，膠承受不了而被燒斷。
⑶ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質
離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用版離子交換柱層析法分離不同的權蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。
⑷ 影響陽離子交換能力的因素有哪些
土壤溶液來中的陽離子進行交自換，稱為陽離子的交換作用。影響因素有——（1）陽離子的代換能力隨離子價數的增加而增大，因為高價陽離子的電荷量大、電性強所以代換能力也大，各種陽離子代換力的大小順序：Na+<K+<NH4+<Mg2+<Ca2+<H+<Al3+<Fe3+（2）等價離子代換能力的大小，隨原子序數的增加而增大（3）離子運動速度愈大，交換力愈強（4）陽離子的相對濃度及交換生成物的性質。
影響土壤陽離子交換量的因素有:陽離子交換量：每千克干土中所含的全部陽離子總量，以厘摩爾（+）每千克土或 c mol(+)kg的-1次冪表示。影響因素——（1）膠體的種類，有機膠體>無機膠體，有機質高的>有機質低的，次生鋁硅酸鹽（2:1>1:1）>次生氧化物（2）溶液的pH值（3）土壤質地，質地愈細交換量愈高。
⑸ 如果一個蛋白質只是在PH6-6.5范圍內穩定，請設計一個通過離子交換層析純化該蛋白質的實驗
你是不是說混淆了，到底是等電點在pH6-6.5？還是等電點未知，確在6-6.5穩定？
我就先按等電點來理解，回答你的問題。
如果對蛋白純化的濃度要求不高，或者待純化樣品成分簡單，雜蛋白少，就選一種離子交換層析，即陽離子離子交換層析（running buffer 設pH5.0比較合適）或陰離子交換層析（running buffer 設pH7.5比較合適）。
如果雜蛋白多，就用兩步離子交換層析，即結合陰陽離子交換層析。一般建議先做陽離子交換層析（這樣第一步可去掉核酸之類的）。不知你要多具體的步驟，先寫個大致步驟吧：
1，陽離子交換層析：將你的樣品置換到pH5.0的running buffer（一般醋酸鈉buffer）。同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（升pH或鹽洗脫），收峰。這步就去掉等電點在6之下的大部分雜蛋白；
2，陰離子交換層析：將所收蛋白置換buffer至pH7.5的running buffer（PB），同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（降pH或鹽洗脫），收峰。去掉pH6.5之上的大部分雜蛋白。
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如果你確實所指在6-6.5穩定，那就看你蛋白的等電點在多少了，只好選一種離子交換層析，在6.5之上就試試pH6.0的running buffer做陽離子交換層析，在6.0之下，就試試pH6.5的running buffer做陰離子交換層析。
若有疑問，歡迎繼續討論，純屬手打，歡迎採納，祝新年愉快！
⑹ 用鎳柱純化過得蛋白還能再進行離子交換嗎
你可以試試。只是鎳柱本質上也是靠電荷吸引力來純化蛋白，和陰離子交換層析有些類似，那些鎳柱無法去除的雜蛋白能否被陰離子交換層析去除，可能需要打個問號。不過兩次純化效果應該比一次好吧。
⑺ 用硫胺沉澱蛋白質後，是否可以立刻對其進行離子交換層析為什麼
用硫胺沉澱蛋白質後，不可以立刻對其進行離子交換層析的
原因很簡單，專離子交換層析屬結合蛋白的要求就地離子強度的條件下結合，也就是低鹽濃度結合
而硫胺沉澱蛋白質後，即使是離心去除大部分硫胺並用去離子水溶解，也依然會有很多硫胺殘留在蛋白溶液中。此時離子強度高，蛋白很難結合上離子交換層析
所以用硫胺沉澱蛋白質後，不可以立刻對其進行離子交換層析的
⑻ 為什麼說離子交換色譜法是分離蛋白質的最佳方法
它是根據蛋白質的組成物質氨基酸的物理性質（基於氨基酸電荷行為）為分離基礎的方法。相對透析和超過濾及凝膠過濾來說，可以針對多種蛋白質中的某一種（前提是知道蛋白質的氨基酸組成及其離子交換樹脂的親和度及洗脫強度）進行分離。（而透析和超過濾還有凝膠過濾方法更大的取決於相對分子質量及其結構 分離出的單一蛋白質純度相對要低 並且凝膠過濾要求凝膠對要求組分不能有吸附作用 適用性較低 ） 相對鹽溶和鹽析來說，分離單一蛋白質的純度要高，且更好的保留其天然理化性（鹽溶要求蛋白質分子吸附某一鹽離子從而改變其溶解性 但有些蛋白質吸附某些鹽離子後其蛋白質構象及理化性會發生改變）。 相對有機溶劑分級分離法，更好的保留其天然理化性（有機溶劑分類法易造成蛋白質不可逆變形 且適用范圍窄） 相對凝膠電泳和等電聚焦來說 更易於實現大量制備分離 且不改變蛋白質結構和功能（電泳會影響蛋白質結構 且操作繁瑣 成本高） 相對親和層析來說 它更加易於實現且成本低廉效果也不錯（親和層析需要制備其配體並與載體交聯 因而制備難且成本較高）
PS: 最好的分離方法不是例子交換色譜法 而是高效液相色譜法 相對離子交換色譜來說有著更高的效率、更高的解析度和過柱速度
⑼ 離子交換層析和親和層析都可以用來分離所有的蛋白質嗎哪種的效果更好
這個你問的太籠統了，方法沒有最好的，只有最合適的
蛋白的分離純化無非是利用版目標蛋白和權別的蛋白不同進行分離，這包括分子量大小，電荷，極性等特性的不同，此外包括別的特性，特別是酶例如酶需要輔酶象蘋果酸 脫氫酶，或者底物，酶抑制劑，金屬離子等，那相對應的純化方法有凝膠過濾，離子交換，疏水層析，後面的可以分別把底物，酶抑制劑，金屬離子偶聯或鰲合到介質上做親和介質，而象果酸脫氫酶也可以用染料親和的辦法，因為染料的結構和NAD類似。糖蛋白可以用凝集素親和或者苯硼酸瓊脂糖親和分離等方法，總之要盡 量多知道目標蛋白的特性和了解各種分離的手段，就很容易找到最有效的分離純化的方法。
⑽ 對於未知蛋白質的分離，應如何選擇恰當的離子交換層析介質
先用陰離子交換樹脂試一下，再用陽離子交換樹脂試一下，跟蹤檢測，看哪個的分離效果好就用哪個。