純化樹脂法提取dna原理

⑴ DNA提取的原理

原理：
1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含雜質較少的DNA。
3.DNA在沸水浴時被二苯胺染成藍色。
方法步驟：
1．提取細胞核物質：順時針方向攪拌，稍快，稍重。 5 min
2．溶解DNA：
3．析出含DNA的黏稠物：蒸餾水300mL，逆時針方向攪拌，緩慢
4．過濾：取黏稠物
5．再溶解：順時針方向攪拌，較慢。3 min
6．過濾：取濾液。
7．提取出含雜質較少的DNA，逆時針方向攪拌，稍慢。5 min
8．DNA的鑒定：沸水浴5min

大學：
DNA提取分為三個基本步驟，每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。
利用研磨或者超聲破碎細胞，並通過加入去污劑以除掉膜脂。
加入蛋白酶，醋酸鹽沉澱，或者酚/氯仿抽提，以除掉細胞內的蛋白，如與DNA結合的組蛋白。
將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉澱，因為DNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。
另外，目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。

2.細胞的破碎
細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎經胞。方法有三種;①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法;②化學試劑法：用SDS處理細胞;③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。

3.DNA提取的幾種方法
(1).濃鹽法
A. 利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿一起搖盪,使乳化,再離心除去蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位於上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉澱出來.
B. 也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.
兩種方法比較,後種方法使核酸降解可能少一些.
C.以稀鹽酸溶液提取DNA 時,加入適量去污劑,如SDS可有助於蛋白質與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,並稱SSC溶液,提取DNA. （2）.陰離子去污劑法; 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由於細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA
（3）.苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由於蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶於酚相，而DNA溶於水相。離心分層後取出水層，多次重復操作，再合並含DNA 的水相，利用核酸不溶於醇的性質，用乙醇沉澱DNA 。此時DNA是十分粘稠的物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態
（4）.水抽提法:利用核酸溶解於水的性質,將組織細胞破碎後,用低鹽溶液除去RNA，然後將沉澱溶於水中，使DNA充分溶解於水中,離心後收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調節至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然後分別用66% ，80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最後在空氣中乾燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.

結果就是得到DNA

⑵ 利用吸附柱純化DNA的原理是什麼

看了樓上一些回答，也是學生命類的吧？

專一性的吸附柱用的是和基因探針一樣的原理，人工合成待純化的DNA的一端一定長度序列的反義鏈，並加到吸附柱上，當混合物經過時，需要分離的DNA分子與柱上的探針結合，被留下，其餘的通過。
這樣的離心吸附柱可以高效、專一地與DNA片段結合,同時最大限度除去蛋白質、離子及引物小片段等雜質。
這樣將寡核苷酸片斷結合到柱上，可回收50 bp-50 kb DNA片段。適用於 DNA溶液中只有單一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需同時回收的情況。

非專一性的和樓上說的差不多。
純化柱是表面偶聯有二乙胺乙醇(DEAE)的親水性樹脂.DNA純化原理為DNA磷酸基帶負電荷, DEAE帶正電荷, DNA可以在0.1～1.4 mol．L-1的相當大的鹽濃度范圍內仍與DEAE 結合, 當低鹽QBT溶液平衡純化柱後, 即可加樣, 用中等鹽濃度的QC洗去RNA和其他雜質, 最後用高鹽濃度的QF將DNA洗脫下來。
由於傳統的離子交換范圍僅在0.4 mol．L-1以內, 使雜質和DNA 洗脫范圍十分接近, 難於達到滿意的純化效果. 但該柱一經使用, 6h後純化效力即開始下降。估計可能得原因有二, 一是樹脂表面親水性強, 極易吸附蛋白, 糖類, RNA等水容物, 從而使原裝柱經幾次循環後吸附過多雜質, 影響了DEAE吸附DNA的能力, 同時雜質阻塞樹脂間隙, 使液體流過柱子的速度明顯變慢, 二是DEAE與樹脂的偶聯並不十分穩定, 在一經使用後的液體環境中,容易逐步解離.

⑶ 簡述dna分離純化的基本原理

磁珠法核酸純化技術採用了納米級磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標記了一種官能團，能同核酸發生吸附反應。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表麵包裹一層硅材料，來吸附核酸，其純化原理類型於玻璃奶的純化方式。離心磁珠是指磁珠微珠表麵包裹了一層可發生離心交換的材料(如DEAE，COOH)等，從而達到吸附核酸目的。不同性質的磁珠微珠所對應的純化原理是不一致。使用磁珠法來純化核酸的最大優點就是自動化。磁珠在磁場條件下可以發生聚集或分散，從而可徹底擺脫離心等所需的手工操作流程。Omega擁有全面的磁珠法核酸分離試劑盒，基於這種技術的試劑盒，名稱前都有』Mag-Bind』。

⑷ 如何從細胞中提取dna

提取基因組DNA和細胞核DNA是不同的方法
提取細胞核要先把細胞破碎分離出細胞核，要在甘油或其他保護劑中進行
SDS十二烷基磺酸鈉：可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離
CATB是一種抽提液，破壞細胞膜的~具體忘了~
DNA不溶於異丙醇，異丙醇可以析出DNA，產生白色絮狀沉澱，用槍頭挑出就可以了
以下是一些具體方法，希望有用
基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為後續的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法,鹼裂解法3生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等

試驗步驟：

1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。

2、細胞重懸於冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h,

5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。

7、2500rpm離心10min.轉上清於一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。

2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶於適量TE中。

外周血DNA提取技術

分離外周血白細胞提取方法：

試驗步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。

3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。

4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。

6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細胞，－80?C凍存。

試驗要求：

血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA：

試驗試劑：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最後加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最後加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最後加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉澱中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置於37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃乾燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉彈，混勻。

NaI提取法提取外周血白細胞基因組：

實驗步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul於eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻後加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置後的反應體系15000rpm離心12min，使沉澱緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘乾（37℃恆溫箱）後，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。

常用的外周血白細胞基因提取方法：

試驗原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑，反復抽提，使蛋白質變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶於水，不溶於有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，並在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞，變性沉澱。離心後有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在於上層水相中，蛋白質則沉澱於兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質。氯仿的作用是有助於水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提後的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉澱DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉澱中的鹽，真空乾燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液於室溫解凍後移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉澱，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h後，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉動幾次，混勻反應液。

3、反應液冷卻至室溫後，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），上下轉動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色雲絮狀DNA出現。用玻璃棒小心挑取雲絮狀的DNA，轉入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復一次。室溫揮發殘留的乙醇，但不要讓DNA完全乾燥。加TE液20ul溶解DNA,置於搖床平台緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。

真核細胞DNA的制備

一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是採用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切後可用於Southern分析，還可用於PCR的模板、文庫構建等實驗。

根據材料來源不同，採取不同的材料處理方法，而後的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。

試劑准備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無水乙醇、75%乙醇

試驗步驟：

材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉移到勻漿器中勻漿。

2)將勻漿液轉移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培養細胞處理：

1)將培養細胞懸浮後，用TBS洗滌一次。

2)離心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍體積的裂解緩沖液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現後，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉澱用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下揮發乙醇，待沉澱將近透明後加50-100mlTE溶解過夜。

植物組織中DNA的提取

試驗原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在於細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質結合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶於0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶於0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質沉澱而除去，得到的是含有核酸的上清液。然後用95％的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質的提取液中沉澱出來。

植物DNA的SDS提取法：

試驗試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解後合並為一，用0.2mol/L的NaOH調至pH7.0，並定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配製成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然後在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之後即將濾液放入冰箱，待結晶出現再置室溫下涼干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標准液：取標准DNA25mg溶於少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，後用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻後用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標准溶液。

實驗步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預冷研磨緩沖液並加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無損轉入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振盪30s，轉入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然後迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液〔提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振盪1min，靜置後在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉澱纏繞在玻璃棒上。

7、然後加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗製品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最後的作用濃度為50～70μg/ml，並在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振盪1min，再除去殘留蛋白質及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

試驗步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉移到加有7ml經預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻後置於65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉離心20min。

4、將上清轉移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉澱緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉澱。1000rpm離心10min，使DNA沉澱於管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置於56℃水浴中過夜。

7、待DNA完全溶解後，加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉澱，挑出DNA，置於15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作台上吹乾。

9、將風乾的DNA直接在4℃保存備用或溶於100μlTE溶液中於-20℃保存。

細菌DNA的提取方法

針對一些不易於提取的細菌的方法:

試驗試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

試驗步驟：

1、抽提緩沖液65℃預熱。

2、加菌體到已經預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振盪，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振盪，以12,000rpm，離心10min。

5、重復再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉澱。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉澱，也可以再用100％乙醇洗，然後溶解於100ml水中。

較為常用的細菌DNA提取方法：

實驗步驟：

1、將菌株接種於液體LB培養基，37℃震盪培養過夜。

2、取1.5ml培養物12000rpm離心2min。

3、沉澱中加入567ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，於37℃溫育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻後再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉入一隻新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉澱下來，沉澱可稍加離心。

6、沉澱用1ml的70%乙醇洗滌後，離心棄乙醇．

真菌DNA提取總結的兩種方法：

第一種方法：

試驗步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振盪混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉澱,混勻,靜置約30min。

7、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。

11、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二種方法：

試驗步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振盪混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。

10、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。
植物基因組提取(CATB法)
作者： 時間：2008-05-13 14:26:27 來源: 生物谷 瀏覽評論

一、實驗目的
掌握植物總DNA的抽提方法和基本原理。學習根據不同的植物和實驗要求設計和改良植物總DNA抽提方法。
二、實驗原理
通常採用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由於植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易於破碎，並減少研磨過程中各種酶類的作用。
十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，並使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心後即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉澱，沉澱DNA溶於TE溶液中，即得植物總DNA溶液。
三、實驗材料
水稻幼葉
四、主要配方
2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, 冷卻後0.2-1% 2-巰基乙醇 （400ul） 氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。
五、實驗步驟
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱。
（2）取少量葉片（約1g）置於研缽中，用液氮磨至粉狀；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；
（4） 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌中，磨碎液的高度約占管的三分之二；
（5）置於65℃的水浴槽或恆溫箱中，每隔10 min輕輕搖動，40 min後取出；
（6）冷卻2 min後，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振盪2~3 min，使兩者混合均勻；
（7）放入離心機中10 000 rpm離心10 min，與此同時，將600 µl的異丙醇加入另一新的滅菌中；
（8） 10 000 rpm離心1 min後，移液器輕輕地吸取上清夜，轉入含有異丙醇的內，將離心管慢慢上下搖動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；
（9）10000 rpm離心1 min後，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉澱倒出，將離心管倒立於鋪開的紙巾上； （10）60 sec後，直立離心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸鈉，輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉澱與管底的DNA塊狀物浮游於液體中；
（11）放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
（12）10000 rpm離心1 min後，倒掉液體，再加入800 µl 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm離心30 sec後，立即倒掉液體，將離心管倒立於鋪開的紙巾上；數分鍾後，直立離心管，乾燥DNA（自然風干或用風筒吹乾）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置於37℃恆溫箱約15 h，使RNA消解；
（15）置於-20℃保存、備用。
2. DNA質量檢測
瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。
六、 注意事項
（1）葉片磨得越細越好。
（2）移液器的使用。
（3）由於植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。

⑸ 分離純化樹脂分離原理是什麼

一般常規樹脂分為離子交換樹脂和吸附樹脂，離子交換樹脂一般是通專過離子作用力進行交換屬分離，樹脂上官能團帶有某電性，需要交換的離子帶有相反電性通過離子的交換實現不同離子的分離。吸附樹脂一般通過孔道中范德華力、氫鍵、親疏水性或極性等作用力實現分離。

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⑹ DNA怎麼提取

DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。化學方式如異硫氰酸胍法、鹼裂解法。生物方式：酶法。根據核酸分離純化方式的不同有；硅質材料、陰離子交換樹脂等。

提取DNA總的原則:

1.保證核酸一級結構的完整性；

2.核酸樣品中不應存在對酶有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

3.其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；

4.其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。

例如 : 用酶法提取

DNA提取分為三個基本步驟，每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。

工具/原料: 研磨棒、研磨儀或者組織破碎儀 , 氯仿：異戊醇（24:1）或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱

方法/步驟 :

1. 使用研磨儀、研磨棒或者使用超聲破碎細胞的方法破碎細胞，加入去污劑，如sds等，除去膜脂。

2. 去除細胞內的蛋白質，包括與DNA結合的組蛋白，通過加入蛋白酶，醋酸鹽沉澱，或者酚／氯仿抽提等方法去除。

3. 加入RNA酶去除RNA，如實驗不嚴密，可省略此步。

4. 沉澱DNA，需在冷乙醇或異丙醇中沉澱，放在冰箱-20℃沉澱30分鍾以上，原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起發生沉澱。

總結: DNA提取方法有下面⑦種

一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

二.甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

四.異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鍾，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

七.鹼變性快速制備：先用NaOH作用20分鍾，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。

⑺ 粗提取 DNA 的原理是什麼純化粗提取 DNA 的原理是什麼  

答案：解析：答案：粗提取DNA的原理是：DNA溶於NaCl溶液但在不同濃度的NaCl溶液中DNA溶解度不同。 純化粗提取DNA的原理是：DNA不溶於冷酒精，但細胞中某些物質溶於酒精溶液。  

⑻ DNA的純化與分離

DNA純化是指將DNA從細胞中提取出來並消除雜質的過程。

純化DNA的第一步是 破碎細胞 。最簡單的方法是在樣本中加入像十二烷基硫酸鈉（SDS）之類的去垢劑。破碎後通過兩種方法能獲得純凈的DNA。

第一種方法涉及降解和去除DNA之外的所有細胞成分，通過添加化學試劑，配合離心，便可獲取。

第二種方法是選擇性地將DNA從細胞抽提物中移除，主要通過 離子交換層析 （ion-exchange chromatography）技術實現。該方法的基本思想是不同物質（帶負電）吸附在正電荷樹脂上的強度不同，而添加不同濃度的鹽溶液可打破物質與樹脂間的結合，通過層析便能分離DNA、RNA與蛋白質。

分離得細胞總DNA後，往往根據需要打碎DNA大分子，形成長短不一的百餘或數百鹼基的小片段。要想進一步利用這些小片段，如測序、克隆、挑選目的片段等，通常是利用 凝膠電泳 的方法。

凝膠電泳是分離不同長度DNA分子的標准方法。電泳常用的凝膠有兩種： 瓊脂糖（agarose）凝膠和聚丙烯醯胺（polyacrylamide）凝膠 。

如果要對各小片段做克隆，利用質粒載體並需轉化（transformation）回寄主，當要 回收重組子 時，必需去除雜質。此時，影響回收的主要干擾是寄主染色體DNA。為了得到重組子DNA，一種常用的方法利用了這樣一個事實。即雖然質粒和染色體都是由超螺旋DNA構成，但在裂解細菌細胞時不可避免地引起一定量的細菌染色體被打斷，從而引起超螺旋的喪失。因此細胞抽提物就包含了超螺旋的質粒DNA和非超螺旋的染色體DNA，然後通過一種利用不同構象區別DNA分子的方法就可以純化出質粒。一種方法是向細胞抽提物中加入氫氧化鈉直到抽提物的pH達到12.0-12.5，這會引起非超螺旋DNA上的鹼基對斷裂。所產生的單鏈DNA纏繞在一起形成不溶的網狀物，通過離心可以去掉，使超螺旋質粒留在上清中。

有時需要 逐條分離染色體 ，可以利用 流式細胞計數儀 （flow cytometry）實現這一目的。對獲取的全DNA染色，由於結合於染色體的染料量依賴於染色體長度，所以較大的染色體結合的染料更多，其產生的熒光比短的染色體強。稀釋染色體樣品後，將其通過小孔以形成液滴流，其中的每個液滴只含單條染色體。當液滴通過可檢測熒光量的檢測儀時，就可以確定哪一滴含有所需的某一條染色體。將含有所需染色體的液滴帶上電荷，使它們在電場中偏轉並與其他的液滴分開。如果兩個不同不同染色體長度相近時，此時若使用的染料不是非特異性結合DNA的，而是對AT或者GC豐富區有高親和力的染料，如Hoechst33258和染色素A3，就可以將二者分開。這是因為兩條大小相同的染色體很少具有相同的GC含量。

T. A. 布朗. 基因組3[M]. 第一版. 北京: 科學出版社, 2009.

⑼ 質粒DNA純化的試驗原理

溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最後，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多溴化乙錠，直至達到飽和( 每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由於染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉澱法。
從大腸桿菌細胞中分離質粒DNA的方法眾多，其分離的依據可利用分子大小不同，鹼基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。鹼基性法抽提效果良好，既經濟且得率較高。抽提到的質量DNA可用於酶切、連接和轉化。對於分子量較大拷貝較少對的質粒DNA，由於DNA片段較大易於損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩定且獲得的質量DNA是超螺旋構型等特點。對於高拷貝數質粒，用少量制備法抽提質粒DNA就有足夠量可用於基因操作。 最近已得到改進（R.Treisman,個人通訊）並達到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質粒。聚乙二醇分級沉澱法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環狀分子同閉環質粒DNA分開，因此， 純化容易帶上切口的極大質粒（大於15kb）。用於生物物理學測定的閉環質粒時，平衡離心仍是首選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足以勝任分子克隆中各種復雜工作的質粒DNA，包括用於哺乳動物細胞的轉染以及利用外切核酸酶產生成套的缺失突變體。
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA。