水和廢水中葉綠素的測定方法

① 測葉綠素的方法

葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法。不過目前應用最為廣泛的還是分光光度法。葉綠素提取液的吸收光譜表明：有兩個強吸收峰，分別在紅光區和藍紫區，不同提取溶劑和原料所得的葉綠素溶液的吸收光譜比較相似。葉綠素a、葉綠素b的紅區最大吸收峰分別在663nm、645nm附近，在藍紫區分別為429nm、453nm附近。由於提取溶劑和原料不同，對葉綠素提取液進行光譜掃描後，所得的最大吸收值可能有較小范圍的浮動。高效液相色譜(HPLC)定量檢測葉綠素含量准確率較高，效果很好。用甲醇和丙酮作為流動相，體積比為80：20時，同時在流動相中加入質量分數為0.1%的冰醋酸，流速為1.0mL/min。利用每一種色素的色譜峰面積進行定量，葉綠素a、葉綠素b的定量可通過外標法由工作曲線求得。[8]穩定性影響因子光在活體植物中，葉綠素得到了很好的保護，既可以發揮光合作用，又不會發生降解。但離體葉綠素對光照很敏感，光和氧氣作用可導致葉綠素不可逆的分解。在自然條件或以膠態分子團存在的水溶液中，葉綠素在有氧的條件下，可進行光氧化而產生自由基，因此一些研究人員認為葉綠素的光氧化降解必需有氧分子參與，而且其降解速率隨氧分子濃度的升高而加快。單線態氧和羥基自由基是葉綠素光化學反應的活性中間體，可與葉綠素吡咯鏈作用而進一步產生過氧自由基和其他自由基，最終可導致卟啉環和吡咯鏈的分解既而造成顏色的褪去。當然影響光氧化的因素有很多，比如體系中的水分、溫度、光照時間、光照強度、光的波長范圍等等，在這些影響因素中主要有光照時間、光照強度、光的波長范圍、氧的濃度。目前在此方面的研究主要集中在自然光(復合光)對色素的影響而且大多數研究不是很深人。對於單色光(不同波段的光)對葉綠素穩定性的影響研究方面的報道卻較少。葉綠素酶已有研究表明，葉綠素酶是一種糖蛋白。葉綠素酶催化葉綠素結構中的植醇鍵而水解生成脫植葉綠素，是葉綠素降解中的關鍵酶。葉綠素酶是以葉綠素作為底物的，它是一種酯酶。脫鎂葉綠素也是葉綠素酶的底物，酶促反應的產物是脫鎂脫植葉綠素。葉綠素酶的最適反應溫度在60～80℃范圍，實驗證明，葉綠素酶在80℃以上其活性下降，100%時已完全失活。溫度一些研究表明，葉綠素提取液在不同受熱溫度下，其降解速率曲線有明顯的拐點，葉綠素在80℃以下，降解速度較慢，90℃以上降解速度急劇加快。總體而言，隨著溫度的升高，葉綠素降解的速率是逐漸加快的，只是較低的溫度下降解速率不明顯。pH值

② 怎樣測葉綠素a 以及怎樣進行藍藻計數

欲知封閉水域會否出現藻類瘋長，如藍藻爆發等現象，應監測水域中的藻類數量以及水質，由於對藻類等浮游植物採用計數的方法測定誤差較大，耗時費力，對檢測人員的工作經驗要求相對較高，一般可測定水中的葉綠素a含量代替藻類測定。當水中的葉綠素a含量突然增高，而且水中含有大量氮、磷等營養物質，加上陽光照射強烈，氣候炎熱等因素，該水域極有可能發生藻類瘋長，可通知各有關部門盡早採取應對措施。

因為藻類是一類含葉綠素的、光合自養的、無胚的原植體植物，在浮游藻類里葉綠素a的含量大約佔有機物比重的1～2%，是估算藻類生物量的較好指標。可預先測定藻類計數和葉綠素含量的相關關系，以葉綠素a的含量來推算藻類的數量，即通過測定水中的葉綠素來快速了解藻類的大致數量。

測定葉綠素a的儀器和方法有許多種，分光光度法測定葉綠素a是一簡便易行的測定方法，水樣經離心或過濾濃縮、研磨、丙酮提取後，定容，取上清液分別測量750nm、645nm、663nm、652nm等幾個波長下的吸光度值，根據經驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量。

分光光度法測定葉綠素a，與測定其他物質稍有不同，如：測磷只需測定單一波長的吸光度值，再以該吸光度值代入由標准溶液測得的校準曲線計算含磷量。而葉綠素a無法使用校準曲線，需用幾個波長下的吸光度值，根據經驗公式來分別計算出各項指標的含量。因為葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b等物質組成，試液是多組分的混合溶液，在試液中分離這幾類物質的難度較大，且無必要。葉綠素a在645nm和663nm 處均有吸收，在645nm處吸光系數較小，為16.75，在663nm 處較大，為82.04；葉綠素b 在645nm和663nm 處亦都有吸收，但在645nm處吸光系數較大，為45.60，在663nm 處較小，為9.27。由此可知：葉綠素a的吸收峰值出現在663nm 處，該吸收曲線延伸到645nm處，在此波長處的吸收系數不如在663 nm 處大，因此在計算公式中求算葉綠素a的含量時，需扣除葉綠素b在663nm和645nm 處的吸光度值，再進行計算。

標准分析方法要求，葉綠體色素提取液不可渾濁，在710nm或750nm波長下測量吸光度，其值應小於葉綠素a吸收峰的吸光度值的5％，否則應重新過濾。假定樣品在663nm處的吸光度值為0.03，則在750nm處的吸光度值不得大於0.0015，對試液的清澈程度要求很高，測量710nm或750nm的目的是避免懸浮物質的干擾，一般測量水中的渾濁度所採用的波長為680nm，為避免在680nm處仍有葉綠素a產生的吸收值，故將測量渾濁度的波長選在710nm以上。在計算公式中，凡參與計算的各吸光度值都應減去710nm處的吸光度值，以扣除懸浮物質的干擾。

採用分光光度法測定葉綠素含量，對測量儀器分光光度計的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm，則葉綠素a的測定誤差為2％，葉綠素b為19％，使用前必須對分光光度計的波長進行校正。校正方法除按儀器說明書外，還應以純的葉綠素a和b來校正。

③ 葉綠素含量測定

常用葉綠素提取試劑： 丙酮 、乙醇、 N，N-二甲基甲醯胺(DMF)
提取方法：研磨、浸泡
丙酮法測定葉綠素含量
乙醇:丙酮:H2O = 4.5:4.5:1 (體積比)
提取方法對比：
常規方法是研磨提取
改進方法是浸泡提取
提取注意事項：

葉綠素a = (12.72A663-2.59A645) × v/w × 1,000
葉綠素b = (22.88A645-4.67A663) × v/w × 1,000
葉綠素總含量 = (20.29A645+8.05A663) × v/w × 1,000

④ 如何測量水體葉綠素濃度，藍藻濃度，微囊藻濃度

可以使用儀器。。請你看以下的內容

因為水藻中也有葉綠體，所以可以檢測到湖泊里的藻類。

SPAD-502 葉綠素儀可以即時測量植物的葉綠素相對含量或「綠色程度」，從而可以了解植物真實的硝基需求量並且幫助您了解土壤硝基的缺乏程度或是否過多地施加了氮肥。您可以通過這種儀器來增加氮肥的利用率，並可保護環境（防止施加過多的氮肥而使環境特別是水源受到污染）。

原理：

SPAD-502 葉綠素儀通過測量葉片在兩種波長范圍內的透光系數來確定葉片當前葉綠素的相對數量。
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當然是PAM-2100和MINI-PAM了！

1983年，WALZ公司首席科學家、德國烏茲堡大學的Ulrich Schreiber教授設計製造了全世界第一台調制熒光儀——PAM-101/102/103，使在自然光下測量葉綠素熒光成為現實，解決了科學界近50年的技術瓶頸。PAM-101/102/103迅速在植物生理、生態、農學、林學、水生生物學等領域得到廣泛應用，出版了大量高水平研究文獻。但該儀器比較笨重，不易帶到野外。

1992年，WALZ公司首席科學家、調制熒光儀發明人、德國烏茲堡大學的Ulrich Schreiber教授設計製造了全世界第一台攜帶型調制熒光儀——PAM-2000，並且在植物生理生態學等科研領域得到廣泛應用，此後十幾年中成為全球最暢銷的調制熒光儀。

1996年，WALZ公司在濃縮PAM-2000功能的基礎上，設計製造了一台更加方便攜帶的超攜帶型調制熒光儀——MINI-PAM。該儀器對PAM-2000的功能進行了濃縮，更加適合野外操作，同時價格也更加便宜。

2003年，WALZ公司在保留PAM-2000所有功能和優點的基礎上，結合最新技術，將PAM-2000升級到了PAM-2100。

PAM-2100

系統描述
PAM-2100採用了獨特的調制技術和飽和脈沖技術，從而可以通過選擇性的原位測量葉綠素熒光來檢測植物光合作用的變化。PAM-2100的調制測量光足夠低，可以只激發色素的本底熒光而不引起任何的光合作用，從而可以真實的記錄基礎熒光Fo。PAM-2100具有很強的靈敏度和選擇性，使其即使在很強的、未經濾光片處理的環境下（如全日照甚至是10000 μmol m-2 s-1的飽和光強下）也可測定熒光產量而不受到干擾。因此，PAM-2100不但適合在實驗室人工控制的環境下測量，還可以在自然環境中甚至是強烈的全光照條件下開展野外科學研究。

PAM-2100是非常便攜、強大的測量系統，它將各種光學和電子元件組裝在一個24 cm×10.5 cm×11 cm的外殼中。測量光由655 nm的發光二極體（LED）發出，可在低頻（600 Hz）和高頻（20 kHz）間自動切換。光化光（光合生物實際可吸收利用進行光合作用的可見光）由鹵素燈（白光）或紅光LED（655 nm）提供。遠紅光（735 nm，促進光系統I迅速消耗掉在PQ處累積的電子）由LED發出。

PAM-2100的按鍵操作非常簡單。基礎測量只需單健操作。數據在內置電腦中自動分析、存儲並且在顯示屏上顯示。除了「參數窗」外，在「動力學窗」還可顯示曲線的實時變化。

PAM-2100利用光纖進行信號傳輸。光適應葉夾2030-B（專利產品）上配備微型光量子/溫度感測器，可在記錄熒光信號的同時，同步記錄光合有效輻射（PAR）和溫度變化。

PAM-2100內設10個標准Run（預先編好的間隔一定時間並按一定順序執行特定命令的程序），用戶只需一次按鍵就可進行復雜的實驗。用戶還可對這些標准Run進行編輯得到自己的User-Run（數量不限），來滿足特殊的實驗需要。
PAM-2100主機可以直接連接電腦（圓口）鍵盤，在野外現場，可以根據實驗需要，不需電腦就可以進行特殊程序的編輯。

PAM-2100還可以設定單機操作軟體DA-2100自動間隔一定時間執行某個Run或User-Run，而Run是可以無限擴展的，因此，可以說PAM-2100的功能幾乎可以無限擴展。只要將主機和葉夾（均可固定在三角架上）固定好，按一次按鍵，（人不在現場看守）儀器可以自動進行非常復雜的測量過程。

此外，PAM-2100主機還可以連接電腦顯示器或投影儀放大顯示，非常適合進行教學使用。

特點
1) 聲譽卓著的PAM-2000的升級版
2) 精巧、准確、迅速、操作簡便的高級光合作用檢測設備
3) 可單機操作（採用內置電腦，DA-2100軟體記錄），可連接外置電腦操作（Windows操作軟體PamWin）
4) 攜帶型設計，帶大屏幕液晶顯示屏（可顯示曲線變化）和20個按鍵
5) 強大的數據收集、分析和存貯功能
6) 可以預先編寫和設定程序，進行特殊研究目的測量
7) 內置鋰電池可滿足長時間野外工作需要，並可連接外置12 V電池
8) 多種葉夾可供選擇，專利設計的光適應葉夾2030-B可同時記錄PAR和溫度變化
9) 光源選擇：自然光，內置光源（提供測量光、光化光、飽和脈沖和遠紅光），可選外置鹵素燈光源（特別適合野外研究）

功能
1) 可測熒光誘導曲線的快速上升動力學O-I-D-P相和O-J-I-P相
2) 可測熒光誘導曲線的慢速下降動力學並進行淬滅分析（Fo, Fm, Fv/Fm, F, Fm, Fo』, dF/Fm』, qP, qN, NPQ, rETR等）
3) 可測光響應曲線和快速光曲線（RLC）
4) 儀器內置一系列標准實驗（Run1～Run10），用戶可對其進行編輯建立自己的User-Run
5) 可在線檢測植物、微藻、地衣、苔蘚等的光合作用變化
6) 單機操作功能強大，特別適合野外操作，實驗室內單機操作時可連接電腦顯示器或投影儀放大顯示

應用領域
儀器設計特別適合野外使用，可用於研究光合作用機理、各種環境因子（光、溫、營養等）對植物生理狀態的影響、植物抗逆性（乾旱、冷、熱、澇、UV、病毒、污染、重金屬等）、植物的長期生態學變化等。在植物生理學、植物生態學、植物病理學、農學、林學、園藝學、水生生物學、環境科學、毒理學、微藻生物技術、極地植物光合作用研究等領域有著廣泛應用。

10個標准Run
Run 1：測量實際量子產量Yield（ΔF/Fm』）
Run 2：測量最大量子產量Fv/Fm
Run 3：記錄誘導曲線並進行淬滅分析（采點率10 ms/點）
Run 4：記錄誘導曲線並進行淬滅分析（采點率30 ms/點）
Run 5：qN 的馳豫動力學
Run 6：快速誘導動力學O-I-D-P相（線性時間）
Run 7：快速誘導動力學O-J-I-P相（對數時間）
Run 8：光響應曲線（需76 min）（稍加編輯即可測量快速光曲線）
Run 9：光響應曲線（需33 min）（稍加編輯即可測量快速光曲線）
Run 10：儀器自檢

用戶可根據實驗需要，自行修改或編製程序。

MINI-PAM

MINI-PAM採用了獨特的調制技術和飽和脈沖技術，從而可以通過選擇性的原位測量葉綠素熒光來檢測植物光合作用的變化。MINI-PAM的調制測量光足夠低，可以只激發色素的本底熒光而不引起任何的光合作用，從而可以真實的記錄基礎熒光Fo。MINI-PAM具有很強的靈敏度和選擇性，使其即使在很強的、未經濾光片處理的環境下（如全日照甚至是10000 μmol m-2 s-1的飽和光強下）也可測定熒光產量而不受到干擾。MINI-PAM是野外光合作用研究的強大工具。
超攜帶型調制葉綠素熒光儀MINI-PAM的特點在於快速、可靠的測量光合作用光化學能量轉換的實際量子產量。此外，MINI-PAM秉承了WALZ公司PAM系列產品的一貫優點，通過應用調制測量光來選擇性的測量活體葉綠素熒光。基於創新性的光電設計和高級微處理器技術，MINI-PAM在達到超便攜設計的同時可以得到靈敏、可靠的結果。同時，MINI-PAM的操作非常簡單。
測量光合量子產量只需一個按鍵（START）操作即可，儀器會自動測量熒光產量（F）和最大熒光（Fm），並計算光合量子產量（Y＝ΔF/Fm），得到的數據會在液晶顯示屏上顯示同時自動存儲。此外MINI-PAM還有許多模式（MODE）菜單，包括熒光淬滅分析（qP、qN和NPQ）和記錄光響應曲線等，以滿足用戶的特殊需要。
連接光適應葉夾2030-B後，可以測量光合有效輻射（PAR）、葉片溫度和相對電子傳遞速率（rETR）。內置電池可以滿足1000次量子產量測量的需要，儀器內存可以存儲4000組數據。
Windows操作軟體WinControl可以進行數據傳輸、數據分析和遙控操作。
標准版的MINI-PAM採用紅光作為測量光。根據用戶需要，我們也可提供以藍光（470 nm）作為測量光的MINI-PAM。

特點
1）聲譽卓著的PAM-2000的濃縮版
2）精巧、准確、迅速、操作簡便的高級光合作用檢測設備
3）可單機操作（採用內置電腦），可連接外置電腦操作（Windows操作軟體WinControl）
4）超攜帶型設計，帶液晶顯示屏和8個按鍵
5）強大的數據收集、分析和存貯功能
6）能耗低，內置鋰電池可滿足長時間野外工作需要，並可連接外置12 V電池
7）多種葉夾可供選擇，專利設計的光適應葉夾2030-B可同時記錄PAR和溫度變化
8）光源選擇：自然光，內置光源（提供測量光、光化光和飽和脈沖），可選外置鹵素燈光源（特別適合野外研究）

功能
1）可測熒光誘導曲線並進行淬滅分析（Fo, Fm, Fv/Fm, F, Fm', ΔF/Fm』, qP, qN, NPQ, rETR, PAR和葉溫等）
2）可測光響應曲線和快速光曲線（RLC）
3）51個內置模式菜單，方便參數設置和標准測量
4）可在線監測植物、微藻、地衣、苔蘚等的光合作用變化
5）功能強大，特別適合野外操作，實驗室內利用WinControl控制時可自編程序

⑤ 葉綠素含量的測定

葉綠素含量的測定方法如下：

葉綠素含量跟光合作用速率、植物營養狀況等指標密切相關，通常，我們會通過對葉綠素含量的測定，來了解植物的生長狀況。一般，植物葉綠素含量測定有三種：分光光度法，活體葉綠素儀法和光聲光譜法。其中分光光度法是應用最廣泛的葉綠素含量測定方法。

葉綠素a,b的丙酮溶液在可見光范圍內的最大吸收峰分別在663nm和645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數分別為16.67和45.60。根據Lambert-Beer定律，我們可以列出方程：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb

D645 = 16.67Ca+45.60Cb

根據以上方程組，可以求得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645

Cb = 22.88D645 – 4.67D663

然後我們又可求得葉綠素總量CT =（D652 × 1000）/ 34.5

95% 丙酮2乙醇(勻漿)的提取效果最佳，因此，我們在進行葉綠素含量測定的時候，可以考慮運用95% 丙酮2乙醇(勻漿)作為提取液。

目前已經發明了比較方便的用於測量葉綠素含量的儀器—葉綠素含量測定儀，它是通過測量植物的葉綠素相對含量來了解土壤的性能指標和植物的硝基需求量，並了解植物的生長狀況。

⑥ 葉綠素含量的測定

葉綠素含量的測定方法：分光光度法。

分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。它具有靈敏度高、操作簡便、快速等優點，是生物化學實驗中最常用的實驗方法。

許多物質的測定都採用分光光度法。在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。

基本原理：選擇吸收

物質與光作用，具有選擇吸收的特性。有色物質的顏色是該物質與光作用產生的。即有色溶液所呈現的顏色是由於溶液中的物質對光的選擇性吸收所致。

由於不同的物質其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有特徵結構的結構集團，存在選擇吸收特性的最大實收波長，形成最大吸收峰，而產生特有的吸收光譜。

即使是相同的物質由於其含量不同，對光的吸收程度也不同。利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質的存在（定性分析），或利用物質對一定波長光的吸收程度來測定物質含量（定量分析）的方法，稱為分光光度法。