Ⅰ 凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理
樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳、氫被氧化為CO2和H2O逸出回，而樣品中的答有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨用NaOH中和生成NH3`H2O，加熱又分解為氨，用硼酸吸收，吸收氨後的硼酸再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定，根據標准酸消耗量計算蛋白質的含量。
Ⅱ 試述用凱氏定氮法測定麵粉中蛋白質含量的原理，簡要步驟和計算公式。
測定蛋白質的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質的物理化學性質來推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類是利用化學方法來計算，如定氮、雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑反應等
主要測定方法有：雙縮脲法、染料結合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法.
目前蛋白質測定最常用的方法是凱氏定氮法，是通過測總氮量來確定蛋白質含量的方法。
凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量,此法的結果稱為粗蛋白質含量：由於樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物，如核酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物.凱氏定氮法是測定總有機氮量較為准確、操作較為簡單的方法之一，可用於所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內外應用較為普遍，是個經典分析方法[6]。至今仍被作為標准檢驗方法.此法可應用於各類食品中蛋白質含量測定
凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經改進後的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦[4].
在理化實驗室,檢驗食品中蛋白質的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來以大量的試驗來比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的精確度的大小.
1.材料與方法：
1.1試驗材料
1.1.1試驗樣品
麵粉
1.1.2試驗葯品和試劑
所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。
硫酸銅；
硫酸鉀；
濃硫酸；
40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶於60mL蒸餾水中；
4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶於蒸餾水中稀釋至lOOmL；
0．1mol／L鹽酸標准滴定溶液；
甲基紅次甲基藍混合指示液：將次甲基藍乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。
1.1.3儀器和設備：
實驗室常規儀器及下列各項：
凱氏燒瓶：500mL；
可調式電爐；蒸汽蒸餾裝置；
鉸肉機：
篦孔徑不超過4nm；
組織搗碎機；
粉碎機；
研缽：玻璃或瓷質；
化學消化器，
凱氏定氮儀，
空氣濾過器
1.2試驗方法
1.2.1微量凱氏定氮法
微量凱氏定氮法的原理
樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然後取消化液的1/10加鹼蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收後再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定[2]。根據標准酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟
1.2.2全量凱氏定氮法
全量凱氏定氮法的原理
樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然後取消化液的全部加鹼蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收後再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定。根據標准酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟
2 分析過程
試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細；不易搗碎、研細的樣品應切(剪)成細粒；干固體樣品用粉碎機粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應用研缽研細)，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機搗碎，混合均勻；肉製品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應放入密閉玻璃容器中，於4°C冰箱內貯存備用，盡快測定。
2.1微量凱氏定氮法的分析過程
2.1.1樣品消化 :
步驟：准確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數粒→小心移入乾燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙捲成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45º斜支於有小孔的石棉網上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠處)，待內容物全部炭化、泡沫停止產生後→加大火力(或將燒瓶放在電爐上)，保持瓶內液體微沸→至液體變藍綠色透明後→繼續加熱微沸30min→關閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉移至100ml容量瓶中，加水定容
2.1.2 蒸餾與吸收：
按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。於水蒸氣發生瓶內裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。准確吸取消化液10mL於反應管內，經漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾並水封，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水進行蒸餾。指示劑變綠色後繼續蒸餾10min，將冷凝管尖端提離液面繼續蒸1min
Ⅲ 凱氏定氮儀測定蛋白質的方法確認怎麼做
最關鍵的是計算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：樣品中蛋白內質的百分含量，容g；
V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；
V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml；
N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；
0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；
m：樣品的質量（體積），g（ml）；
F：氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。
Ⅳ 粗蛋白的測定有沒有比凱氏定氮更好地方法呀
主要成分是蛋白質。檢驗方法是剴氏定氮法。
蛋白質的測定方法
pro的測定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量，另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸、鹼性基團和芳香基團測定pro含量。但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測定通常利用經典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標准酸液吸收，用標准酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計算出pro的含量。由於食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。
一 凱氏定氮法
這種方法是1883年Kjeldahl發明，當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量穀物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間，後來由Gunning加入改進，他改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。
我們在檢驗食品中pro時，往往只限於測定總氮量，然後乘以pro核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核酸、生物鹼、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物，故稱為粗pro。
1 凱氏常量定氮法：
不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，首先第一個步驟是消化：
（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。並破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中。
（2）在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀後，溫度可達400℃，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。
為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。
所以有機物全部消化後，出現硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為鹼性反應指示劑。
（1）蒸餾：樣液中的硫酸銨在鹼性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。
（2）吸收與滴定：
蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標准硫酸或標准鹽酸溶液進行氨的吸收，然後再用標准氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收後，再用標准鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用。
1．操作步驟：
准確稱取樣品中0.50-2.00g→於500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風櫥中先以小火加熱，待泡沫消失後，加大火力，消化至透明無黑粒後，將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶於硫酸中→繼續消化30分鍾→至到樣液呈綠色狀態，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波動珠數粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶內殘液減少到三分之一時，取出用水沖洗→用0.1N HCl滴定。
N（V2-V1）0.014
W
計算：
總氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100
0.014----氮的毫克當量數
pro%=總氮%×K
乳製品K=6.38（N=15.7%）
小麥粉K=5.79（N=17.6%）
動物膠K=5.6（N=18.0%）
冰蛋K=6.7（N=14.8%）
大豆製品K=6.0（16.7%） K=6.25則（N=16%）
K-換稱等數
各種試劑的作用:
濃H2SO4：
A ：脫水使有機物炭化，然後有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變為CO2
B： 氧化
C： pro與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑
D： NH3與H2SO4生成硫酸銨
（1）CuSO4的作用（催化劑）
CuSO4為紅色沉澱，當C完全消化後，反應停止，紅色消失，變為蘭色，即為消化達到完全，蘭色為CuSO4的顏色
（2）K2SO4的作用（提高沸點）
沸點由330℃提高到400℃加速了反應過程。
（3）硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常採用硫酸銅
（4）50%NaOH的作用
下面我就針對幾點來說明為何影響氨化完全和速度快的因素:
（1）K氏燒瓶和取樣量
如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對於縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。
（2）分解劑
A H2SO4和K2SO4的添加量
有機無分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g樣品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml
這種比例在國內外都使用，是公認的
還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml
B 催化劑
用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對Hg，HgO有毒但結果好，Se與CuSO4得到結果是一種，TiO2，的結果偏低，採用不同的催化劑則消化時間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測定結果時要註明催化劑的類型。
（3）熱源的強度
消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。
（4）氨的蒸餾和吸收及滴定
蒸餾有兩種:
1 直接蒸餾（裝置簡便，准確性好）
2 水蒸汽蒸餾
蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高於這個理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。
吸收液有：
1標准H2SO4 用標准鹼返滴定，甲醛紅指示劑
2 硼酸 用HCl進行滴定，混合指示劑
目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用4%。
〈6〉實驗注意事項
a.樣品應時均勻的，若是固體樣品應事先研細，液體樣要混合均勻。
b.樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。
c.消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷後，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。
d.在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。
e.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。
f.混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。
g.氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為鹼性。
h.向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱無。這時由於分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。
i.消化劑綠色後繼續消化30分鍾即可。
2 K氏微量定氮儀法
3 K氏半微量定氮儀法 (2 、 3原理一樣)
操作方法大同小異，半微量法消化後，定容100ml，然後吸25ml蒸餾吸收液吸收。
N（V2-V1）0.014
W＊10／100
計算總氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100
對於微量定氮儀法，儀器有了改進，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。
4 K氏自動定氮法
原理與上面一樣，儀器，採用K氏自動定氮儀：其裝置內具有自動加鹼蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數字顯示裝置，消化裝置：由優質玻璃製成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。
二 水揚酸比色法：
1 原理： 樣品中的pro經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液後，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。
2 方法 （1）標准曲線的繪制
取6個25ml容量瓶編號 0 1 2 3 4 5 6
分別加空白酸液 2ml
分別加磷酸鹽緩沖液 5ml
稀釋至總體體積至15ml
分別加水揚酸鈉 5ml
37C水浴 15分鍾
加入次氯酸鈉 2.5ml
37C水浴 15分鍾
取出試液於660nm下進行比色，繪標准曲線。
（2）樣品處理：
准確稱樣0.20~1.00g→於K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化劑→電爐上加熱到沸騰後→加大
火力消化→直到出現暗綠色時→搖動瓶子→K氏瓶全部消化後→冷卻→加水至250ml容量
瓶。
（3）樣品測定：
准確吸取上述消化溶液10ml→於100ml容量瓶中→定容→准確吸2ml→於25ml容量瓶中→加
5ml磷酸緩沖液→以下操作與標准曲線繪制的步驟相同
並以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標准曲線查出其含氮量。
（4）計算
C×F
含氮%= ---------------------------× 100
W×1000×1000
C---從標准曲線中查出測定樣液的含氮量（Ug）
F---樣品溶液的稀釋倍數
W---樣品重量（g）
pro%=總氮%×K（K可為6.25，也可查）
3注意事項：
A 當天消化液最好當天測定，結果重現性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。
B 當在PH和試劑適當范圍內加入氯源後，顏色的顯色和溫度有關，應嚴格控制反應溫度。
C 這種方法測定結果基本與K氏法一致。
4 試劑
（1）氯標液：稱經110℃乾燥2h的硫酸銨0.4719g→於燒瓶中定容10ml→此液1ml相當於
1.0mg氮標液→使用時配製成1ml相當於2.50Ug氮標液。
（2）空白酸液：稱0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化劑→與樣品一樣消化→定容250ml→
使用時吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。
（3）磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉→加38g磷酸三鈉→加20g三九石酸鉀鈉→加400ml水
溶解→過濾→另稱35gNaOH溶於100ml水中→冷至室溫→緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中→加
入水稀釋至1000ml備用。
（4）水揚酸鈉溶液：稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶於200ml水中過濾，加水稀釋
至500ml
（5）次氯酸鈉溶液：吸4ml安替富民液，用水稀釋至100ml
5 儀器
（1）分光光度計
（2）恆溫水浴
三 紫外分光光度法
1 原理：
pro及其降解產物的芳香環基 ，在紫外區內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度（3~8mg/ml）成直線關系，因此，通過測定pro溶液的吸光度，並參照事先用K氏定氮法分析的標准樣品，從標准曲線查出蛋白質的含量。
2 試劑：
（1） 0.1mol/l檸檬酸水溶液。
（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氫氧化鈉液
（3） 95%乙醇
（4） 無水乙醚
3 儀器
（1） 751型的紫外分光光度計
（2） 離心機
4 操作方法
（1）標准曲線的繪制：准確稱取樣品.2.00g，置於50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鍾使其充分溶解，用四層紗布過濾於玻璃離心管中，以每秒鍾3000~5000轉的速度離心10分鍾，分別吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml於6個10ml容量瓶鍾，每個容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鍾（如果離心再次離心），取透明液於比色皿中，在280nm下測定其吸光度。（做參比值）
以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質的含量微橫坐標上面的吸光度為縱坐標，繪制標准曲線。
（2）樣品測定
准確稱取試樣1.00g→於50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鍾→四層紗布過濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻後於280nm下測吸光度，從標准曲線上查出pro的含量。
計算： 蛋白質= C/W× 100
C----從標准曲線上查得的pro含量（mg）
W----測定樣品溶液相當於樣品量（mg）
說明：
a.此法運用於糕點，牛乳和可溶性pro樣品，測定糕點時，應把表皮顏色去掉。
b.溫度對pro水解有影響，操作溫度應控制在20~30℃。
四 雙縮脲法-皮尼克法
1 原理：
雙縮脲在鹼性條件中，能與CuSO4結合成紅紫色的絡合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結構相似，也呈此反應。本法直接用於測定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進行定量。
2 試劑
⑴甘油作為穩定劑：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO450ml。
⑵酒石酸鈉作穩定劑，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO4液40ml。
配製以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。
3 方法：樣品測定
標准曲線繪制
准確稱0.6g樣品→使用試劑（1）
准確稱0.5g樣品→使用試劑（2）
假如用試劑（2）
（1）准確稱樣→0.5g→於80ml離心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩定劑→蓋上蓋子離心10min（4000轉/分）→放置1小時→吸混合液15ml→於20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml於→10ml容量瓶→加水定容→於550nm處測定吸光度，從標准曲線上查出pro含量。
（2）標准曲線繪制
按樣品測定方法，根據樣品中pro含量，取離心澄清樣液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml於10ml容量瓶中→分別加水定容，按照樣品測定其吸光度。
事先用K氏定氮法測定樣品中pro含量為橫坐標，以上述吸光度為縱坐標繪制標准曲線。
4 計算：蛋白質%=C/W×100
C----從標准曲線上查得得pro含量（mg）
W----測定樣液時相當於樣品重量（mg）
Ⅳ 試述用凱氏定氮法測定麵粉中蛋白質含量的原理，簡要步驟和計算公式。
麵粉與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液滴定。
1、 樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。
2、 裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
3、 向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標准溶液定至灰色或藍紫色為終點。 同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100% X：樣品中蛋白質的百分含量，g； V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml； V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml； N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度； 0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數； m：樣品的質量（體積），g（ml）； F：氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。
Ⅵ 凱氏定氮法測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些
凱氏定氮法只能檢測蛋白質中氮含量，不能檢測氨基酸的含量。其中蛋白質含量也只是稱為粗蛋白質的含量，只是用氮的含量乘以6.25（系數）得出，不是真正的蛋白質的含量。
凱氏定氮法測氮的方法如下：
1、稱取0.5～1g試樣（含氮量5～80mg）准確至0.0002g，無損失地放入凱氏燒瓶中，加入硫酸銅0.9g，無水硫酸鉀（或硫酸鈉）15g，與試樣混合均勻，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮爐士小心加熱，待樣品焦化，泡沫消失，再加強火力（360～410℃）直至溶液澄清後，再加熱消化15min。
2、氨的蒸餾
（1）常量直接茂餾法 將上述的試樣消煮液冷卻，加蒸餾水200ml，搖勻，冷卻。沿瓶壁小心加入40％氫氧化鈉溶液100ml，立即與蒸餾裝置相連．蒸餾裝置冷凝管的末端應浸入50ml硼酸吸收液lcm。加混合指示劑2滴，輕搖凱氏燒瓶，使溶液混勻，加熱蒸餾，直至餾出液體積約150ml。先將吸收液取下，再停止加熱。
（2）半微量水蒸汽蒸餾法 上述試樣的消煮液冷卻，加蒸餾水20m1轉入100ml容量瓶，冷卻後用水稀釋至刻度，搖勻，為試樣分解液。取2％硼酸溶液20ml，加混合指示劑2滴，使半微量蕉餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸餾裝置的蒸汽發生器的水中應加甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，且保持此液為橙紅色，否則應補加少許硫酸。准確移取試樣分解液10～20ml注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，並在入口處加水封密好，防止漏氣，蒸餾4min，使冷凝管末端離開吸收液面，用蒸餾水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨後，立即用0.05mol/L的HCI標准溶液滴定，仍以甲基紅或混合甲基紅為指示劑。
在測定樣本中含氮量的同時，應做一空白對照測定，即各種試劑的用量及操作步驟完全相同，但不加樣本，這樣可以校正因葯品不純所發生的誤差，吸收氨後的吸收液立即用0.05mol/L鹽酸標准溶液滴定，溶液由藍綠色變為灰紅色為終點。
4、空白測定 稱取蔗糖0.0lg，以代替試樣，按上述測定步驟進行空白測定，消耗0.05mol/L鹽酸標准溶液的體積應不得超過0.3ml。
5、計算
N%*6.25=粗蛋白質（%）=（V2-V1）*0.014*6.25*100/m*（V』/ V）
每m1的lmol/L鹽酸標准溶液相當於0.0140g的N。因此，
式中：v2—試樣滴定時所需酸標准溶液的體積（m1）；
v1—空白滴定時所需酸標准溶液的體積(m1)；
c—鹽酸標准溶液的濃度(mol/L)；
m一試樣的質量（g）；
v —試樣的分解液總體積（ml）；
v』—試樣分解液蒸餾用體積（m1）；
0.0140—每ml HCl標准溶液相當於N的克數；
6.25一氮換算成蛋白質的平均系數。
每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。 當粗蛋質含量在25％以。上，允許相對偏差為1％；當粗蛋白質含量在l0％～25％時，允許相對偏差為2％；當粗蛋白質含量在10％以下時，允許相對偏差為3％。
Ⅶ 凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量的原理和基本操作方法是什麼
原理：有機含氮化合物與濃硫酸共熱消化，氮轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨。硫酸銨與強鹼反應，放出氨。將氨蒸餾到過量的標准無機溶液中，再用標准鹼溶液進行滴定。根據測得的氨量，計算樣品的總氮量。
、試劑與材料：
濃硫酸、硫酸鉀-硫酸銅粉末(稱取80g硫酸鉀和20g硫酸銅(五水)，0.3g二氧化硒研細混合)、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液、0.01M標准鹽酸、混合指示劑(田氏指示劑)儲存液(取50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅溶液混合，儲存於棕色瓶中備用。此指示劑在PH5.2為紫色;PH為5.4為暗灰色或灰色;PH5.6為綠色;變色點為PH5.4)、硼酸-田氏指示劑混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加約1ml田氏指示劑，搖勻後，溶液呈紫紅色)、蛋白質樣品、容量瓶、吸管、凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、微量滴定管、電爐
三、操作方法
1、樣品處理：固體樣品，應在105℃乾燥至恆重。液體樣品可直接吸取一定量，也可經適當稀釋後，吸取一定量進行測定，使每一樣品的含氮量在0.2-1.0mg范圍內。
2、消化：取一定量樣品，於50ml乾燥的凱氏燒瓶內。加入300mg硫酸鉀-硫酸銅混合粉末，再加入3ml濃硫酸。用電爐加熱，在通風廚中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加熱，避免泡沫飛濺，不能讓泡沫上升到瓶頸，待泡沫停止發生後，加強火保持瓶內液體沸騰。時常轉動燒瓶使樣品全部消化完全，直至消化液清澈透明。
另取凱氏瓶一個，不加樣品，其它操作相同，作為空白試驗，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，以對樣品進行校正。
3、蒸餾：將微量凱氏蒸餾裝置洗滌(先用水蒸氣洗滌)干凈。將凱氏燒瓶中的消化液冷卻後，全部轉入100ml的容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。
吸取20ml稀釋消化液，置於蒸餾裝置的反應室中，加入10ml30%氫氧化鈉溶液，將玻璃塞塞緊，於漏斗中加一些蒸餾水，作為水封。
取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示劑混合液，置於冷凝管之下口，冷凝管口應浸沒在硼酸液面之下，以保證氨的吸收。
加熱水蒸汽發生器，沸騰後，夾緊夾子，凱氏蒸餾。三角瓶中的硼酸-指示劑混合液，吸收蒸餾出的氨，由紫紅色變為綠色。蒸餾15min，讓硼酸液面離開冷凝管口，再蒸1-2min以沖洗冷凝管口。空白試驗按同樣操作進行。
4、滴定：樣品和空白均蒸餾完畢後，用0.01M標准鹽酸滴定，至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。
四、計算 樣品總氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20
式中：A：樣品滴定時消耗的標准鹽酸體積 B：空白滴定時消耗的鹽酸體積 C：標准鹽酸的當量濃度 14：氮的相對分子量 20：用於蒸餾的稀釋消化液體積 100：稀釋消化液的體積
樣品中粗蛋白含量(mg)=樣品總氮量(mg)×6.25
Ⅷ 凱氏定氮法測定蛋白質，蒸餾液加入過量的氫氧化鈉後呈色
綠色
因為所用混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。
Ⅸ 蛋白質測定中，定氮蒸餾時，水蒸氣發生器中的水為什麼保持酸性
水中也含有氮元素，為防止水中的氮元素隨水蒸汽揮發出來，可以加硫酸使之生成硫酸銨留在水中