油包水pcr纯化

1. PCR产物纯化时 用的是什么纯化，扩增完直接纯，还是要跑胶

pcr产物是用胶回收试剂盒还是直接pcr产物纯化试剂盒
不是的，pcr纯化试剂盒—是直接水溶解的pac产物就可以回收，回收效率高，但是只适合单一条带需要纯化测序的时候使用。
pcr凝胶试剂盒—是在pcr产物是混合物，有多条杂带的情况下，先跑胶将杂带分离，然后在将你所要的条带位置的胶切下回收，后者的回收效率低，但是很纯净。pcr产物纯化试剂盒去除的是pcr反应体系中的离子、dntp、引物以及聚合酶，收集其中的dna片段。这只适合于几乎没有非特异性条带的pcr产物的收集。如果你的pcr产物具有非特异性条带，那么一定需要使用胶回收试剂盒。

2. 如何纯化pcr产物或粗提的dna

DNA纯化的步骤是：

1.2-25倍100%的酒精冰箱中先预冷，降温后再加入DNA中；

2.低温，冰中反应5min至更长时间；

3.低温，离心；

4.加70%乙醇清洗两遍；

5.加TE溶解DNA.

3. 用于与载体连接的pcr酶切产物是如何纯化的

跑胶后找到目的片段，切胶回收，纯化的传统法就是将PCR产物加入2倍体积的乙醇－20度沉淀过夜后低速短暂离心（如 3000rpm离心1~2min)，弃掉上清，然后用70%乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解。当然这种方法对PCR产物纯化后回收率是很低的，你需要多做几管PCR，然后一起纯化回收。
但是现在实验室一般都是用PCR产物纯化试剂盒，回收纯化的效果要好得多。

4. 如何纯化PCR产物为什么总是不纯

你说的是PCR产物的纯化吧？
先用溶液溶解含DNA的琼脂糖凝胶，然后加入有吸附柱的离心管中
吸附柱吸附DNA
离心，将含琼脂糖的溶液去除；
接下来加入去盐的漂洗液进一步去除杂质；因PH值的原因，DNA还是吸附在吸附柱上的膜上；
最后加入纯水或者TE溶解液，在这个条件下DNA会溶解在其中，通过离心将液体离下来，得到的液体就是纯化好的PCR产物了

5. PCR纯化的原理

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

6. PCR纯化的意义

使在PCR过程中扩增出的目的片段在得率上提高、特异性增强、浓度上提高等，说白了就是是最终产物的纯度增加，以便提高后续实验的成功率。
纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。蛋白的分离纯化常见方法，离子交换、分子筛、疏水层析、亲和层析等。

7. PCR扩增目的基因以后，怎么用琼脂糖电泳回收及纯化呢希望高手指教！

可以用回收试剂盒。举例如下：
DNA的回收使用AXYGEN公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，回收步骤如下：
1、 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl体积）；
2、 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75 ℃加热，,间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全融化（约6-8 min）；
3、 加0.5个Buffer DE-B，混合均匀；
4、 吸取步骤3中混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml( 试剂盒内提供)离心管）中，12,000×g离心1 min，弃滤液；
5、 将制备管置回2 ml离心管，加500 μlBuffer W1，12,000×g离心30 s，弃滤液；
6、 将制备管置回2 ml离心管，加500 μlBuffer W2，12,000×g离心30 s，弃滤液，用同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1 min；
7、 将制备管置回2 ml离心管，12,000×g离心1 min；
8、 将制备管置于洁净的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备膜中央加25-30 μlEluent，室温静置1 min，12,000×g离心1 min洗脱DNA。
如果片段较大，如几千kb以上建议用promega公司的回收试剂盒这样效果较好。
具体的步骤什么的回收试剂盒里均有说明书。

8. 基因测序，pcr对纯水有什么要求

PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术,广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等.与传统克隆测序技术相比较,直接对PCR扩增的DNA进行测序,省去了耗时的克隆步骤,避免了传统的细菌培养,模板提取等重复性操作,可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息.PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点. 试验试剂 PCR扩增的双链DNA模板长约20个核苷酸的DNA引物 DNA聚合酶测序胶 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L) 测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl 终止缓冲液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05% 二甲苯腈试验步骤： 1、 4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC温浴5min,备用. 2、 在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96OC加热8min,冰浴泠却1min,4OC 10000g离心10s. 3、 加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,测序酶2U,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链. 4、 在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物,37OC温浴5min.每管各加入4μl终止液. 5、 样品在80OC的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl 加到测序胶上,电泳分离这些片段. 注意事项： 1.?PCR产物要有一定的长度(>200bp),因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低. 2.?纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时,可直接通过酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法来纯化. 3.?测序引物设计原则类似于PCR引物设计,可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物,经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,即可用作测序引物. PCR循环测序法 PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子. PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视. 试验试剂： DNA测序试剂盒 dNTP ddNTP 丙烯酰胺双丙烯酰胺尿素 TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 6%测序胶：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE. 10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明胶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP 终止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) 终止缓冲液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈试验步骤 1、 4个小离心管,每个小管加入3μl的终止混合液,将管子放在冰上. 2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×测序缓冲液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加双蒸水到30μl彻底混匀,每管7μl加入上面4个小管中. 3、 反应液上加30μl的石蜡油. 4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30个循环,可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数. 5、 反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀. 6、 上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min,每一道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段. 注意事项： 1、 制备测序模板：PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后,用于序列分析；可经过柱层析纯化,去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 产物也可不经纯化直接用于测序,但是这种测序产生的结果较差,建议测序之前应进行PCR产物的纯化.各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用.用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用.但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列,否则将会导致测序实验的失败. 2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记,反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链.引物的浓度不宜高,否则容易形成引物二聚体,或产生非特异性的扩增引物. 3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序,其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用.虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定,但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要,而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术.该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列.它的应用减轻了DNA序列测定的工作量,提高了测序的效率.

9. PCR产物是用胶回收试剂盒还是直接PCR产物纯化试剂盒

如果确定PCR产物很纯（没有引物二聚体），完全可以用PCR产物纯化试剂盒。

如果PCR产物不是很纯，或者PCR扩增条带比较小，PCR产物前面又有较多引物二聚体时，用胶回收，其余用PCR产物纯化试剂盒。

pcr纯化试剂盒和胶回收试剂盒的区别：

PCR纯化试剂盒：是直接水溶解的PAC产物就可以回收，回收效率高，但是只适合单一条带需要纯化测序的时候使用。

PCR凝胶试剂盒：是在PCR产物是混合物，有多条杂带的情况下，先跑胶将杂带分离，然后在将所要的条带位置的胶切下回收，后者的回收效率低，但是很纯净。

胶回收试剂盒操作步骤：

1. 配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。

2. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA的片段切下来。并尽量去除多余的凝胶。

3. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1g/ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；

4. 转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去液体。

5. 将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室温下，10,000×g离心 1分钟，去弃滤出液；这一步相当关键，不要忽略此步。

6. 将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，去弃滤出液；注：SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释。

7. 将柱子重新套回收集管中，重复加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，去弃滤出液；

8. 弃去液体，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体。

   这步可以去除柱子基质上残余的乙醇，不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的。

9. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20度。

10. PCR产物纯化时 用的是什么纯化，扩增完直接纯，还是要跑胶

那要看你的PCR产物有没有非特异性带，如果你PCR产物跑胶后很纯的只有一条带（不算引物二聚体），那么就不需要切胶纯化，传统法就是将PCR产物加入2倍体积的乙醇－20度沉淀过夜后低速短暂离心（如 3000rpm离心1~2min)，弃掉上清，然后用70%乙醇洗涤一次后，弃掉乙醇，放干后再用无菌水或者TE溶解。当然这种方法对PCR产物纯化后回收率是很低的，你需要多做几管PCR，然后一起纯化回收。所以你最好去买PCR产物纯化试剂盒，这个方法现在只是没有试剂盒的情况下应急的。如果是PCR产物跑胶后有两条以上的带，那么你就得切胶回收目的片段，推荐这个时候还是买切胶回收试剂盒，传统法不是没有，但现在用的太少。如果有兴趣了解，欢迎追问。 但无论哪种情况，纯化前后都需要跑电泳的。