马铃薯纯化水

① 马铃薯原生质体如何制备、分离纯化

马铃薯原生质体制备和拟南芥、烟草、蚕豆、小麦原生质体制备方向相似。本人对这几个材料都用过，但我感觉马铃薯、蚕豆和小麦的原生质体还是比较容易制备的，成功与否关键在于材料生长时期的正确选择。最好组织较嫩、具有适度的叶绿体。马铃薯种子在营养土中种植10天左右，用嫩的茎叶就可以做原生质体。或者在MS培养基上种植的幼苗也可以用。多做几次就掌握了，关键是自己的经验。祝你好运。
1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。
3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）
10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。

Solution Recipes

Enzyme solution
1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)

1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)

1.09 g mannitol

1ml 0.3M KCl

1ml 0.3M MES, pH 5.7

Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding

1ml 0.15M CaCl2

1ml 0.75mM β-mercaptoethanol

1ml 1.5% BSA

PEG solution (40%, v/v)
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!

0.75 ml H2O

0.625 ml 0.8 M mannitol

0.25 ml 1M CaCl2

W 5
1000 ml

154 mM NaCl 9.0 g

125 mM CaCl2 18.4 g

5 mM KCl 0.37 g

5 mM glucose 0.9 g

0.03% MES 0.3 g

pH to 5.8 with KOH

autoclave 20 minutes in 125 bottles

MaMg solution
100 ml

15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2

0.1% MES 0.1 g

0.4 M mannitol 7.3 g

pH to 5.6 with KOH

autoclave 20 minutes in 125 ml bottles

References
1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.e/sheenweb/

② 红曲霉可以用pda培养吗

红曲霉的营养要求不高，在PDA琼脂平板上是可以生长的。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基简称为PDA培养基，是一种运用十分广泛的培养基，并采用去皮的马铃薯、葡萄糖、琼脂为原料，去皮的马铃薯除食用外，还可适用于霉菌和酵母菌等真菌类生物的培养，以及用于食品中酵母菌含量的计数。

中海生物技术马铃薯葡萄糖琼脂培养基属于固体半合成培养基，主要成分为马铃薯的营养提取物，马铃薯中富含大量的淀粉、蛋白质、氨基酸、矿物质及多种维生素，有助于各种霉菌的生长；葡萄糖是最为重要的一种单糖广泛分布在自然界中，是生物生长的主要供能物质；琼脂在此培养基中主要作为凝固剂。

【产品特点】

中海马铃薯葡萄糖琼脂培养基经脱水处理后制成脱水干粉培养基，使培养基便于长期保存及运输；培养基使用方便，只需加入适量的纯化水或注射用水，经高温灭菌后即可使用，解决了繁琐的操作步骤和耗时长的问题；并且该培养基在不同批次之间差别较小，提高了PDA培养基的质量以及酵母菌的检出率；马铃薯葡萄糖琼脂所含成分中营养物质高，提高了微生物对营养物质的利用率，从而促进菌体的生长发育。

③ 食用菌母种

食用菌母种：子实体中分得的菌种称为母种。
可以找专门做食用菌的实验室帮你做。一般用PDA培养基或者水琼脂培养基就可以。
仪器设备有：75%和95%的酒精，次氯酸钠，超净工作台，平皿，试管，滤纸，解剖刀，镊子，干热或湿热灭菌设备。
方法：
1 制备培养基：称马铃薯200g，琼脂20g，蔗糖或葡萄糖20g，琼脂20g，取马铃薯削皮洗净，切成拇指大的小块，加入1000ml水煮至马铃薯块一触即烂，用四层纱布过滤，将滤液继续加热放入琼脂并搅拌直至琼脂完全溶解，加入蔗糖，装置容器内（一般为三角瓶，如是试管可直接分装）灭菌。
2 灭菌后，如是试管直接摆斜面，如是平皿在超净工作台内分装，待培养基凝固即可用。
3 开始分离母种：将采集到的野生菌，与要用的所有仪器试剂一起放入超净工作台内，紫外杀菌30mim，采用子实体分离方法，用酒精盯烧过的镊子和刀取菌种中未接触到空气的部分，黄豆粒大小，放入平皿培养基内，封号口放入26度的培养箱内3-5天，如未染菌，则在菌肉周围会有菌丝长出，此为母种。在超净工作台内，用接种针将菌丝挑出，放入试管中，继续纯化培养，放入恭喜你，分离成功！！！
满意不？？？

④ 关于冰水提纯过程

北极的冰块主要为降雪积累冰化而来。由于北极没有污染，没有灰尘。所以里面的杂质很少，无需提纯就可以达到普通纯水的要求。

⑤ 如何分离酵母菌

马铃薯葡萄糖琼脂培养基