纯化水微生物取样放置时间验证

1. 纯化水微生物限度检查操作

纯化水微生物限度操作规程
文件编号
总
页
数
共
3
页
制订部门
实施日期
起
草
人
审
核
人
批
准
人
起草日期
审核日期
批准日期
1.
目的
本规程旨在为微生物限度检查提供一个标准化方法。
2.
适用范围
微生物限度实验室
3.
责任者
QC
主管生测员
4.
安全注意事项
严格无菌操作，防止微生物污染。
5.
规程
5.1
取样
a
．在车间、实验室所有用水点按序取样，标明日期和取样点位置，一个监测
点取水
3
次，一次
250mL
，送检验室按中国药典
2010
年版二部标准进行全检。
b
．
取样前将直接接触样品的容器用
75%
酒精棉球进行擦拭，
采用灭菌后瓶收
集样品。
c
．取样时，取样人洗手并消毒，取样前用纯化水淋洗检验用取样瓶和瓶塞
3
次。灭菌瓶至少取
200mL
用于微生物检验用水，微生物检验应在取样后的
1
小
时内进行，或将样品冷藏并在
4
小时内进行检验。
5.2
微生物限度检查
纯化水检验标准微生物限度检查采用平皿法和薄膜过滤法。
5.3
微生物培养
（
1
）
除另有规定，
本检查法中细菌培养温度为
30-35
℃，霉菌、酵母菌培养温
度为

2. 纯化水检查中各指标质检的原理

4.整个水质监测分为三个“验证”周期，每个周期7天
4.1.1.纯化水箱
取样频率：每天取样一次 检测项目：理化指标、微生物指标、电导率 检测方法: 按企业《纯化水检验规程》（根据中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）执行。 标准：《纯化水质量标准》（根据现行中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）。
4.1.2.总送水
取样频率：每天取样一次 检测项目：理化指标、微生物指标、电导率 检测方法: 按企业《纯化水检验规程》（根据中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）执行。 标准：《纯化水质量标准》（根据现行中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）。
4.1.3.总回水口（附件13性能确认水质检测报告） 取样频率：每天取样一次 检测项目：理化指标、微生物指标、电导率 检测方法: 按企业《纯化水检验规程》（根据中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）执行。 标准：《纯化水质量标准》（根据现行中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）。
4.1.4.各使用点
取样频率：每个“验证”周期轮流取样一次，共3次 检测项目：理化指标、微生物指标、电导率 检测方法: 按企业《纯化水检验规程》（根据中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）执行。 标准：《纯化水质量标准》（根据现行中国药典2010年版二部纯化水标准及微生物检测标准制定）。
4.2. 异常情况处理程序
4.2.1.在纯化水制备系统性能确认过程中，应严格按照系统标准操作程序、维护保养程序、取样程序、检验规程进行操作； 按质量标准进行判定，当个别取样点纯化水质量不符合标准的结果时，应按下列程序处理； 4.2.2.在不合格点重新取样，重新检测不合格项目或全项；必要时，在不合格点的前后分段取样，进行对照检测，以确定不合格原因；
4.2.3.若附属系统运行方面的原因，需报验证小组，调整运行参数或对系统进行处理。
5. 纯化水制备系统日常监测。
若连续3周（每7天为一个连续周期）的检测结果均在合格范围内，可做性能确认通过的评价。测试周的数据结果列在一个表中。各车间正常用水继续日常监测，最后确定管路清洗消毒周期。
5.1.取样点的布置
5.1.1.纯化水箱，每周取样1次
5.1.2.送、回水管每周取样1次
5.1.3.使用点可轮流取样，但需保证每个用水点每月不少于1次
5.1.4.验证周期结束后，每隔30天对微生物指标进行检验。
5.2.检测方法：中国药典2010版二部
5.3.管路清洗消毒周期的确认
5.3.1.当纯化水箱水样、送、回水管水样，各使用点水样其中任一水样细菌、霉菌和酵母菌总数大于100个/ml时必须对管路进行清洗消毒，（两次间隔时间为清洗消毒周期）
5.4质量管理部拟订日常监测程序及验证周期；执行《工艺用水质量监控程序》。
5.5.日常监控验证持续一年；
5.6.按标准测试，测试结果附入验证方案.
6.纯化水制备系统验证的结果评价及建议 工程部负责收集各项验证、试验结果记录，根据验证、试验结果起草验证报告、仪器标准操作程序、维护保养程序，报验证委员会。 验证委员会对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书，确认系统日常监测程序及验证周期。

3. 微生物检验常见问题解答

微生物检验常见问题解答

你知道什么是微生物检验吗?你对微生物检验常见问题了解吗?下面是我为大家带来的微生物检验常见问题解答的知识，欢迎阅读。

一、方法验证

1.做过验证的样品微生物检验方法是否都需要按照新的方法进行重新验证?

答：对于微生物限度检查的产品而言，由于培养时间调整，应重新进行验证。对于无菌检查的产品而言，如果方法未作实质性调整，可以不必重新验证。个别产品在各论中收载了新的无菌检查方法，对这些品种，应对收载方法的适用性进行验证。

2. 以前做过无菌验证的品种是否需要重新按照新的标准再验证?

答：参见问题1。

3. “新增抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜” 比如注射用克林霉素磷酸酯属于抗生素，是否需要重新选取滤膜再验证?

答：目前采用的方法如果经验证表明可行，则可以继续使用该方法。

4. 微生物方法学验证时，培养时间是否跟样品日常检验所培养时间一致?

答：应该一致。

5. 微生物限度验证时，如果一个方法只有金葡回收率达不到要求，该方法时是否可以用来做细菌霉菌的检测方法?

答：按药典的规定，一个计数方法通过验证，是指所有试验菌的回收率均达到要求。如果采用各种方法以及方法的组合仍无法使金葡回收率达标，则可以采用使金葡回收率最高的方法作为计数方法。

6. 薄膜过滤的冲洗量不能超过1000ml，我公司的喹诺酮类产品原来的方法是每张膜冲洗量为1500和2000ml，请问有没有合适的方法将冲洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合规定?

答：有几种办法可以降低冲洗剂的用量：1)降低接触滤膜的供试品的浓度;2)改进冲洗的方式，如少量多次地冲洗、降低蠕动泵的转速等;3)添加中和剂，如高价金属离子。

7. 微生物限度检查法规定，技术方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品检验。请问，上述方法是指仅通过一种方法还是一定要通过几种方法联用的?

答：应该要把可能采用的所有方法包括方法联用都进行验证。

8. 供试品不溶于稀释剂，同时又有抑菌性，限度检查时应如何消除抑菌性?

答：采用低速离心的方式，尽可能把供试品去除干净，取离心后的上层液，进行薄膜过滤。

9. 不溶于水的固体产品，加表面活性剂后，如何操作才能在方法验证中得到较好的回收率?

答：同问题8。

10. 有些品种2010年药典与2005年比较检验方法变了，是否需要验证或确认?

答：同问题1。

二、菌种管理

1. 浓菌液的有效期该如何确定?

答：药典没有规定。可以通过实验确定有效期。例如，在不同的时间点测定浓菌液的浓度，从而判断其有效期。

2. 药典要求菌液在制备后2小时内使用，若保存在2-8℃的菌悬液可在在24小时内使用，那我们在做验证或阳性对照是要加一定量的菌就没有时间进行平板计数了，该如何确保所加菌量准确?

答：药典对稀释菌液的使用期限作出规定，并不会影响操作过程中稀释菌液的加入。即便不规定，也无法在准确知道菌液浓度的情况下加入试验菌。菌液稀释的实验操作和加入菌液的实验操作应该是在同一次实验中完成的，要使加入的菌量符合药典的规定，可以从浓菌液的制备方法、菌液稀释的方法等方面进行规范，也可以引入浊度比较的方法。

3. 菌悬液能否在倒平板之前确定菌含量?

答：活菌含量是无法确定的。总菌量可以通过比浊的方式确定。

4. 具体从哪些方面进行菌种菌株的特性和纯度确认?如何操作?

答：基层的微生物实验室进行菌种纯度确认可以考虑以下一些方面：1)形态学鉴定，包括菌落形态和染色形态;2)生化鉴定，可以考虑使用API鉴定系统。

5. 黑曲霉冻干菌种如何转种，传代?

答：与其他菌种一样，所不同的是使用的培养基应改为改良马丁琼脂培养基。

6. 干粉状的是否可做第0代使用?

答：只要是菌种保藏机构提供的冻干保藏的菌种，可以确定为第0代。

7. 菌种每次传代都要做纯度、特性等的确认吗?

答：从外部购入的菌种，在进入本实验室的菌种保藏体系时，需要进行纯度和特性的确认。以后的每次传代，可以通过显色培养基做简单的确认即可。

8. 如采用低温保存菌种，需购买哪些设备?能够到省所进行实际操作培训?

答：低温冰箱，应能够提供-70℃的低温。可以到省所来培训。

9. 做方法验证时，工作用菌种能否同时操作，如何防止交叉污染?

答：可以同时操作。避免交叉污染的关键是无菌操作技术。

10. 是否等菌悬液的含菌数出结果后再做适用性等检查?

答：没有必要。可参见问题2。

11. 菌液制备中菌液是否都要验证储存期?

答：稀释菌液可参考药典规定。如要保存浓菌液，则需要验证有效期。

12. 菌种CMCC是否可以用ATCC替代，从省所或中检所购买的菌种是否每次都可以出具规范的COA?

答：中国药典使用CMCC的菌种，并没有规定可以使用其他等效的菌种。省所提供的菌种严格讲属于标准贮备菌种，无法提供ATCC这样的COA。CMCC至今也无法提供这类证明。

13. 铜绿假单胞如何保藏?答：可以使用低温冷冻保存的方法。14. 工作用菌液是否属于亚培养或传代一次?

答：工作用菌液应属于一次传代。

三、微生物限度

1. 包装材料的大肠埃希菌检查?

答：根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查;另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定的方法检验。

2. 抗真菌药品的微生物限度检查法

答：这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜过滤法或培养基稀释法等方法。

3. 为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照(国外不需要)?

答：为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的`。

4. 对于同一个品种，药典为什么不规定统一的检测方法?

答：本版药典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如注射用头孢类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。

5. 梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中?

答：需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。

6. 控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理?

答：在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。

7.常规的监督抽样检品(包括原料)在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查并在原始记录与报告书中体现?

答：需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。

8. 药包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符合规定，如何进行?

答：每个瓶子分别进行实验。

9. 大肠埃希菌具体操作规程?

答：参见中国药品检验标准操作规程。

10. 动物组织及动物类原药材的提取物入药，是否需要检沙门菌?

答：需要进行沙门菌检查。

11. 关于中国药典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。

答：不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2010年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目前的规定应该比05版更为清晰、明确。

12. 需做沙门菌检验样品量的确定?

答：10g(ml)用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g(ml)。

13. 日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求?

答：完全可以。可以采用厌氧培养盒(罐)。

14. 如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照?

答：每个规格均需进行阳性对照。

15. 细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗?

答：可以。

16. 培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗?

答：可以。这样更为严谨。

17.中国药品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”如何理解?

答：该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版药典和2010年版药典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。”产品检验中应以药典规定为准。

18. 无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液?

答：可以。

19. 制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测?

答：可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。

20. 在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应参照哪个时间进行培养。

答：应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。

21. 测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适?需要先稀释吗?过滤完后需不需要冲洗?假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计数是以5ml为单位还是10ml为单位?

答：过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲洗。每张滤膜的过滤量为5ml。

22. 2010药典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数限度是多少?霉菌及酵母菌总数限度又是多少?

答：是总数不得过100个。没有必要考虑各自的限度值。

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4. 微生物取样后为什么要在4小时内送检

因为取样后微生物离开了本来的生活环境，要保持微生物的活性就必须在适宜的环境下进行培养，不然生物活性消失以后检验就不准确了，四个小时是维持生物活性的一个时间段，条件允许的话当然是尽快送检比较好。

5. 中国药典2020版纯化水微生物限度培养时间

3天。
培养时间“3天”“5天”改为“接种细菌的培养管培养时间不超过3天，接种真菌的培养管培养时间不得超过5天”。

6. 纯化水取样后多长时间内检验微生物

然后点燃。这样细菌，再说情况哈、残留酒精都没有了，再用无菌瓶取样回。在两小时内送往实验答室做检测。
检查
①
取样装置容器有没有被污染
②
取样的操作过程是否被污染
③
取样回检验室的路途有没有被污染
④
检验过程有没有被污染
⑤
培养过程有没有被污染
注意以上五个问题，进行重复取样检验。如果电导率小于2的话一般实际水中的细菌不会超标的。所以确认设备本身没有被细菌污染的情况下，首先要考虑的问题就是取样的方法。
可以先用酒精涂满接水口的四周首先需要鉴别是哪里出了问题，所以光检测储罐、总送和总回是不够的，还需要检测产水或一级ro膜出水的微生物，甄别是否为ro出现问题；其次总回比储罐及总送微生物限度低是由于精密过滤器过滤的原因，差异较大说明ro出现的问题的可能性较大；另采用巴氏主要是控制微生物，最好采用次碱洗，然后平时定期采用巴氏消毒

7. 纯化水的再验证周期应该如何制定

纯化水系统应做持续取样，长期监控，并每年进行数据汇总分析结果，设置警戒限和纠偏限，超出后采取偏差处理，企业可根据风险评估结果制定再验证周期。

8. 纯化水微生物限度检查方法

在医药的生产过程中，纯化水的质量是关系到药品质量的一个首要原因。纯化水在生产，储存和运输的过程中，非常容易受到微生物的污染，因此对于水质的日常检测是质量部门一个重要工作。对于纯化水微生物限度检查，各国所使用的方法不外乎与培养基浇注法，涂布法，膜过滤法，以及最大可能数法，最大的区别在于所使用的培养基不同。

我总结了以下对于纯化水微生物限度检查方法，同时我司熟悉纯化水检测相关标准和检测项目要求，可提供专业、可靠的纯化水检测服务，出具国家认可的纯化水微生物限度检查报告。cma资质认证如下：

对于活力比较强的微生物，在高营养性培养基上可以快速大量的生长，而对于活力比较差的微生物，生长速度会比较缓慢。在日常生活中，这两种微生物经常会同时出现由由于它们的生长速率不同，会产生无法完全检出的现象，因此高营养性培养基和低营养性培养基常常会同时使用来提高微生物的检出率，

培养的温度和时间同样是影响检测的条件，高营养性培养基通常在30-35℃培养48-72小时，但是在同一个系统中，培养的时间越长，可以检出的微生物数量就越多，低营养性培养基就在这时候被设计出来，有些培养基的培养时间甚至达到14天，可以至大化的复苏低营养性微生物及受损伤的微生物。但是检测周期的延长，对于工作效率来说，是很不利的，因此我们需要一个既能保证效率，又能保证检出率的办法。

在比较了中国药典，美国药典中所记载的方法，中国药典中纯化水微生物检查所用到的培养基是 R2A 琼脂培养基，在30-35℃培养大于5天。美国药典中对于纯化水的微生物检测用何种培养基没有做强制性规定，只要求在水系统确认验证及周期性确认验证时，使用适当的方法对水系统中的微生物做出评价即可。

《中国药典》2010版、2015版以及2020版纯化水微生物限度检查中表示，生产企业必须确保纯化水的质量符合药典要求，但药典对于纯化水的规定其实也只是至低水平，满足了药典的标准不一定就能保证符合企业预期用途的要求。因此，开展纯化水微生物限度检查直接影响到生产产品的安全质量，中科检测具有纯化水微生物限度核查检测，具有独立实验室，报告具有CMA和CNAS资质。

9. 纯化水验证微生物每个周期检多少次

是的，总共分3个周期，第一周期每天都得检，现在开始最好做得正规一些，做FDA要求更加严格

10. 纯化水各个取水点的监测 可以把 微生物检验 跟理化检验 放在两天吗比如 今天检查微生物 明天再检查理化

最好不要
否则纯水的PH值和电导率发生变化，虽然理论上说这种变化数值很小，专但是验厂的那些人不理解，很难解属释的。
同样，如果你储存时有微生物滋长的话，PH值变化就很大了。
因此，你最好是取2瓶水，1瓶做微生物，1瓶做理化