强阳离子交换柱基线不稳

1. 2. 蛋白质组学样品前处理（3）

说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。

我们通过上一篇笔记里介绍的各种方法把蛋白质提取出来以后，这事儿还没完，因为我们需要对提取出来的蛋白进行一下质控，以确认是否成功提取出了足够的蛋白，是否有污染等。

如上图，质量控制分两个部分：

含量测定 ：检测是否有充足的蛋白被提取出。注意上图里提到的不兼容问题，如果你样品里加过SDS，就不要用Bradford法来测定蛋白浓度，而可以选用BCA方法；反之，如果你样品里加入了还原剂，就不要用BCA方法来测定蛋白，可以选用Bradford法。

SDS-PAGE ：检测蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我们上了50个样，能看到的条带却很少，说明定量不准确。如果想从几组样品中寻找差异蛋白，特别需要做一次SDS-PAGE检测同类样品蛋白的提取效率。

以上图为例，0号样品中间的条带不见了，可能是提取蛋白不充分引起的差异，也可能是样品本身的差异。我们可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差异；如果是样品本身的差异，建议用label free的方法，每个样品单独做定量，而不要用iTRAQ或TMT标记定量，否则会因为中间这个高丰度蛋白的影响，而导致定量不准。

我们再看来几种常见的问题，以及解决方法，如下图：

情况1：提取出来的结果差异很大。这种情况需要重新提取，以检测到底是提取不充分造成的差异，还是样品本身的差异；

情况2：左边是分子量marker,右边是实际样品，可以看到实际样品的条带很少，可能是提取不充分，需要重设提取参数，使用更剧烈的条件，更长的时间，重新提取；

情况3：横纹、纵纹比较多，很可能是核酸或脂蛋白的影响，这种情况需要进行脱盐处理，也就是利用脱盐柱与肽段结合，而与其它物质不结合，从而达到去除污染的目的。

情况4：两个条带很类似，但一条明显比另一条淡。可能造成这种情况的原因有哪些呢？第一种情况，由于这是同样类型的样品，比如都是小鼠肌肉组织，一个样品的蛋白质抽提充分，而另外一个样品蛋白抽提不充分，就会导致两条带不一样，这种情况下需要重新抽提。还有一种可能，考虑到是等量上样跑的SDS-PAGE，如果两个条带显示出的蛋白含量差别很大，则可能因为参考的含量测定结果不准确引起的，这时候需要重新定量。

蛋白提取后，还需要做脱盐处理，我们来看看可以用哪些方法实现。

超滤： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积较小的样品。操作步骤可以是，从100μL超滤浓缩到40μL，再加缓冲液至100μL，再超滤到40μL，反复几次。事实上，超滤是很难把污染（比如SDS）完全去掉的，最终仍然会有极少量的污染物存在，但当这些污染物的浓度降到一定程度时，则样品的纯净度我们认为是可以接受的了。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积比较大的样品，比如尿液，可以将盐透析至外面的透析液里。

丙醇沉淀 ：-20℃丙酮（V _样品 ：V _冷丙酮 =1：3以上）沉淀2个小时以上。

C18色谱柱脱盐法 ：Waters公司生产的XBridge C18色谱柱，利用柱子上的填料与蛋白结合，而盐类物质则流穿过去，从而达到分离的目的。

脱盐完成以后，接下来我们就要进行相当重要的一步：还原烷基化及酶解。整个流程，大伙儿看下面这张图：

这里面有两件事要先跟大伙儿聊聊。

首先，我们来说说为什么步骤里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通过之前的学习，我们知道丙酮可以溶解样品的去污剂、还原剂等，而蛋白是不会在丙酮中溶解的，而是会沉淀下来，这样就达到了去除杂质的目的。

烷基化以后，球状蛋白变成链状，再通过丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后复溶（即重新溶解，以备下一步酶解操作），那么链状的蛋白比球状蛋白的复溶效果会更好，可以避免因为复溶不充分而造成的损失。因此，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。

另外，关于酶切这一步，有些抗体如果只用胰酶进行酶切，由于酶切位点太少，导致切出来的肽段太长，不便于质谱检测。这种情况下可以结合其它酶，比如Lys-C，进行多酶酶切，使肽段变得短一些。经过测试我们发现，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鉴定率。

酶解需要在buffer体系下完成，比如25mM碳酸氢铵体系（易挥发，pH 7-8）最为常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺盐，10-100mM）。

酶的用量可以参考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能与SDS同时使用。

前面提过，质谱仪是一种离子饱和性仪器，高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制，并且质谱仪反应也需要一定的时间。例如，人的细胞内通常会表达20300种蛋白，它们酶解后，每种蛋白会产生10-20种肽段，那么就有几十万种肽段，质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级，可以降低检测的难度，得到更多的肽段/蛋白鉴定结果。

我们既可以从蛋白水平进行分离，也可以从肽段水平进行分离，还可以将多种分离手段结合起来。从蛋白水平的分离，大家都比较熟悉吧？通常我们用SDS-PAGE或IEF等技术，利用蛋白质的分子量、形状、等电点等理化性质的不同，将混合在一起的蛋白质分开。

第二种分离方案是在肽段水平上进行，根据肽段的不同性质，使用不同填料进行分离。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅胶为基质的强阳离子交换柱，可以与阳离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阳离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阳离子的肽段分离的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅胶键合季铵基团的强阴离子交换柱，可以与阴离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阴离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阴离子的肽段分离的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色谱柱，与正相柱在表面键合极性官能团不同，反相柱的表面键合的是非极性的官能团，例如，键合十八烷基官能团，称为C18柱，其它常用的还有C8，C4和C2等。这里我们选用C18柱，根据肽段疏水性的不同，达到分离的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：亲水色谱柱可以用来分离极性化合物。由于强极性肽段在反相色谱柱中保留情况都比较差，很难将它们分开，而亲水色谱柱却可以用来固定强极性的肽段，并结合高比例有机相与低比例水相组成的流动相，来实现分离的目的，且这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相条件，结合pH2的RPLC酸性条件，进行分离。

多维分离：例如，先从蛋白水平进行分离，再从肽段水平进行分离，或者多种肽段水平的分级分离结合起来使用。接下来我们重点聊一下各种多维分离的策略和效果。

我们先来看看上面这张图。左上角的“A图“展示的是通过High pH - Low pH RPLC将样品分成了40个馏分，然后进行叉开的合并，合并为20个馏分，这样的合并可以让样品中的肽段分布更加均匀。

右上角的”B图”展示的是通过SDS-PAGE进行分离，也分成20个馏分，然后用两种合并方案，分别合并为5个馏分和6个馏分，这样做的目的也是为了让样品的肽段分布更加均匀。

左下角的“C图”针对同一种样品，对High/Low pH RPLC和SDS-PAGE两种分离策略进行了比较，发现经过两种分离方法后，有5408个蛋白是都可以鉴定到的，另外有1951种蛋白是只在High/Low pH RPLC分离策略中鉴定到的，而用SDS-PAGE分离，则可以鉴定到其它389种蛋白。从这个图上看，两种方法有互补性。

右下角的四幅小图说明，当我们在做分级分离时，分的级别越多，能鉴定到的蛋白也就越多。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。所以比较省时省力又能保证效果的做法时，选择一个合适的分级数即可。

我们来看一下目前发表的文献里，利用多级分离所能鉴定到的蛋白数量。

就像前面说到的，对蛋白及多肽分离的级数越多，能鉴定到的蛋白也就越多，但常常因为机时的限制，再加上这种变化趋势到一定程度总会饱和，所以我们通常有个权衡。比如常规的分10个馏分，基本上可以鉴定到5000-8000个蛋白。如果是血清样品，可以馏分更多一些，尤其是RPLC一维，如果分到40或60个馏分，再合并为10或20个馏分，比直接分成10个或20个馏分能鉴定到的蛋白要多30%左右！

样品前处理的各个步骤就介绍到这，下篇将继续分享样品前处理的最新方法与进展

2. 气相色谱基线问题

你的问题可能有两方面的原因。一个是你每次样品分析完之后，色谱柱内的化合物没有吹扫干净，或者你没有老化好色谱柱所致，所以每次开机后色谱柱中流出上一次分析残留的物质，导致基线杂峰很笑裂多。另一个是你的载气有问题，老化色谱柱对色谱柱本身产生伤害，从而导致每山散次老化后色谱柱基线不稳，不老化还好，一老化就出问题，因为老化的温度较高。关于色谱问题建逗升氏议你到“生化色谱网”去看看，那里非常专业。

3. 气相色谱为什么温度升高就基线不稳,降低温度基线就好了、

不知道你的谱图是什么样子的？能否把你的所谓的基线有锯齿状的谱图拆斗宴传上来看看。一般情况下程序升温都会有基线的波动。但是如果波动很大的话，尤其是在升温的时候这种锯齿状的基线出现销卜就会要看看你的检测器是否玷污了，柱子也可能污染了旅银。从你的情况我推测原因是上面的。有时候电路线头接触不良也导致基线的波动，载气的不干净也会导致这种现象的发生。

4. 使用高效液相色谱仪时，监视器的基线不平是什么原因导致的

使用高效液相色谱仪时，监视器的基线不平的原因包括：未平衡，梯度，柱内滞留杂质出峰。

仪器本身的电噪声，仪器无法屏蔽产品的外部信号的干扰信号，工作站软件的信号线连接时接触非仪器方面的输入信号，都会引起基线的规则性波动和突发性波动；这种不稳定一般可以通过基线信号的规律判断出来的。

色谱柱

应按各品种项下的规定，常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。流动相与固定相之间应互不相溶，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。

以上内容参考：网络-高效液相色谱

5. 磺酸基阳离子交换柱的磺酸基阳离子交换柱产品

Venusil SCX HPLC Columns强阳离子交换柱
粒径5um 孔径300A 比表面积50m2/g
强阳离子交换柱：以超纯硅胶为基质，表面键合有芳内香族磺酸基团。容300A，5um；比表面积50m2/g。可用于分离碱性、水溶性化合物和生物分子。中国药典2005版中，盐酸二甲双胍的有关物质测定方法即使用磺酸基阳离子交换（SCX）色谱柱。
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*100mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*150mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*250mm/5um
三聚氰胺VSc 958505-m Venusil scx4.6*250mm/5um
（建议配保护柱卡套使用寿命更长）

6. 哪些化合物适用于强阳离子交换色谱哪些适用于强阴离子交换色谱

强阳离子交换色谱和强阴离子交换色谱是两种常用的分离和纯化化合物的技术。

强阳离子交换色谱是一种用于分离和纯化有机阳离子的技术。它通常用于分离和纯化含有有机阳离子的化合物，例如碱性氨基酸、氨基苯甲酸等。

强阴离子交换色谱是一种用于分离和纯化有机阴离子的技喊衫术燃塌。它通常用于分离和纯化含有有机阴离子的化合物，例如羧基苯甲酸、磺基苯甲酸等。
注意，不同的化合物可能同时郑段腔含有有机阳离子和有机阴离子。在这种情况下，可以使用其他技术来分离和纯化这些化合物，例如层析色谱、静电场色谱等。

另外，还有一些化合物没有明显的有机阳离子或有机阴离子，例如烷基苯甲酸等。这些化合物通常不适用于强阳离子交换色谱或强阴离子交换色谱。

7. 离子色谱基线走不稳的原因

造成基线漂移的原因有很多种：环境、温度、电压等变化都会引起基线的变化，而基线的变化直接影响样品结果的准确性，往往微小的漂移都会造成样品数值较大的偏差。

离子色谱的分离机理主要是离子交换，有3种分离方式，它们是高效离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱和离子对色谱。

用于3种分离方式的柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换功能基和容量各不相同。

(7)强阳离子交换柱基线不稳扩展阅读：

高效离子交换色谱，应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，这在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂；

以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架，在苯环上引入磺酸基，形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂；

此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构，以便于快速达到交换平衡，离子交换树脂耐酸碱可在任何pH范围内使用，易再生处理、使用寿命长，缺点是机械强度差、易溶易胀、受有机物污染。

8. 气相色谱中柱补偿是什么意思

这个术语一般是用在热导检测器中的。
也就是你如果不是单池热导猛渣核，需要平衡气。有时也叫做柱补偿。

另外一种情况是，色谱柱基线不稳而产生的术语，解释起来比较梁含复杂。枝掘

9. 在高效液相色谱分析中，如果基线不稳定，是什么原因引起的

高效液相色谱仪分析中的基线不稳定的原因一般是硬件引起的可以从两个大方向去判断：

1、产品质量方面的故障：仪器本身的电噪声，仪器无法屏蔽产品的外部信号的干扰信号，工作站软件的信号线连接时接触非仪器方面的输入信号，都会引起基线的规则性波动和突发性波动；这种不稳定一般可以通过基线信号的规律判断出来的；

2、使用和维护范围内的基线不稳定：流动相流路中有气泡会引起规律性的小波动；色谱柱污染则会导致基线大幅度的波动和各种不规则的出峰，检测器污染也会导致基线的不稳定1、柱温波动。（即使是很小的温度变化 都会引起基线的波动。通常影响示差检测 器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测 器或其它光电类检测器。） 1、控制好柱 子和流动相的温度，在检测器之前使用热 交换器图 2、流动相不均匀。（流动相条件变化引 起的基线漂移大于温度导致的漂移。） 2 、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添 加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中 使用氦气。 3、流通池被污染或有气体 3、用甲醇或 其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要， 可以用1N的硝酸。（不要用盐酸） 4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池 窗口破裂，产生噪音基线） 4、取出阻塞 物或更换管子。参考检测器手册更换流通 池窗。 5、流动相配比不当或流速变化 5、更改 配比或流速。为避免这个问题可定期检查 流动相组成及流速。 6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流 动相时，在分析前用10-20倍体积的新流 动相对柱子进行冲洗。 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配 成 7、检查流动相的组成。使用高品质的 化学试剂及HPLC级的溶剂 8、样品中有强保留的物质（高K 值）以 馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步 升高的基线。 8、使用保护柱，如有必要 ，在进样之间或在分析过程中，定期用强 溶剂冲洗柱子。 9、使用循环溶剂，但检测器未调整。 9 、重新设定基线。当检测器动力学范围发 生变化时，使用新的流动相。 10、检测器没有设定在最大吸收波长处，将波长调整至最大吸收波长处

10. 强阳离子交换和弱阳离子交换的区别

这是包含关系。质子交换膜是阳离子交换膜中的一种。阳离子交换膜可能透过除了质子的其他阳离子