dna能不能穿过高效过滤器

㈠ 初效、中效、高效过滤器之间有什么区别

初效，中效，亚高效，高效空气过滤器有什么区别初效又称粗效，主要是保护下一个过滤段中回效，答中效就是保护下一个过滤段高效。主要的区别：材质不同，过滤级别不同。如果高效段前不安装初中效那么高效就会在很短的时间内报废，中效也一样。

㈡ 高效空气过滤器有什么作用 对人体是否有伤害

导语：当今社会环境污染越来越严重了，各种汽车的尾气，装修房屋的气味等都需要清除，大多数人都会想到购买高效空气过滤器，因为高效空气净化器过滤效果高，而且容尘量很大，适合大工业作业量的场所，有效保护呼吸健康，高效空气过滤器是工业场所使用率很高的一种空气净化设备，那么这种空气过滤器有什么作用呢?随小编一起看一看。

高效空气过滤器—简介

高效空气过滤器主要用于捕集0.5um以下的颗粒灰尘及各种悬浮物。采用超细玻璃纤维纸作滤料，胶版纸、铝膜等材料作分割板，与木框铝合金胶合而成,采用特殊硅橡胶作,无气味,表面不会硬化,时间长也不会有裂纹,化学性能稳定，耐腐蚀，可吸收热胀冷缩产生的应力而不会开裂，软硬度适中，弹性恢复好。

每台均经钠焰法测试，具有过滤效率高、阻力低、容尘量大等特点。高效空气过滤器可广泛用于光学电子、LCD液晶制造，生物医药、精密仪器、饮料食品，PCB印刷等行业无尘净化车间的空调末端送风处。高效和超高效过滤器均用于洁净室末端，以其结构形式可分为有：有隔板高效、无隔板高效、大风量高效,超高效过滤器等。

高效空气过滤器——作用

高效空气过滤器洁净技术控制过滤的灰尘一般是0.110m的尘埃粒子，粒径较小，包含有固态微粒和液态微粒;大气中悬浮的有机微粒有微生物、植物的花粉、花絮与绒毛，微生物一般包括病毒、立克次氏菌、细菌、菌类、原生虫和藻类。高效空气过滤器控制的主要是细菌和菌类、病毒。

因为微生物主要附着在尘埃粒子上，因此将空气中的尘埃粒子有效地控制，也就能有效地控制空气中的细菌、菌类及病毒。要做到这一点，必须通过阻隔性质的微粒高效空气过滤器，方可加以过滤。一般地，普通高效空气过滤器对细菌的过滤效率可达99.996，基本上可以满足生物洁净室的过滤净化要求。

高效空气过滤器——对人体是否有伤害

高效空气过滤器对人体是有好处的，很多经常在无尘车间上班的员工经常会有疑问：经常在无尘车间里工作，里面的空气对人体会不会有影响呢?答案当然是否定的，我们都知道，无尘车间里的空气主要是经常末端的高效空气过滤器进行过滤过后才送到室内的，员工所说的空气主要就是指经过高效空气过滤器过滤后的空气。

高效空气过滤器本身是由极细的玻璃纤维纸制作而成，本身的过滤精度可以达到99.99%过滤0.3um以上，也就是说大气中的大部分能看到的和不能看到的尘埃包括细菌载体等都被过滤掉了才送到无尘车间内部的，员工所吸收的空气其实比外界要干净很多，因此高效空气过滤器总体而言，对人身体是有好处的。

结语：空气净化器主要由滤芯和壳体两部分组成。基本要求是过滤效率高、流动阻力低、能较长时间连续使用以降低后期耗材成本。其中滤芯即是指空气过滤器，高效空气过滤器在空气净化行业中起着至关重要的作用，它能够捕捉到空气中的有害颗粒、灰尘杂质，并对其进行杀菌净化，让空气还原洁净。关于高效空气过滤的相关内容就介绍到这里了，希望能帮助到大家。

㈢ DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些

质粒抽提流程详解——沉淀菌体
检查细菌培养情况，将明显浑浊的菌液倒在已经编号的2ml的沉菌用离心管里，在约12000转/min的速度下离心沉淀1分钟，保证无悬浮物后取出；将离心管倒扣在卫生纸上，用力敲击，至液体培养基完全去除；如发现菌体沉淀的少，可多加2ml菌液重复沉菌一次。
在离心管中加入250µl 加过RNaseA1酶的Buffer S1，用振荡器震荡，直到沉淀完全充分悬浮。
1. Buffer S1是什么？主要组分是什么？
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0

2. Buffer S1的功能是什么？
50 mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果Buffer S1中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
EDTA ：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在Buffer S1中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 ——但是对于测序而言，我们是用水溶解质粒，所以EDTA是必须的。

3.如果抽提质粒恰好Buffer S1用完了，可不可以用水代替？
只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

质粒抽提流程详解——裂解
在离心管中加入250µl Buffer S2，上下缓慢颠倒7~8次至混旋液澄清（这步的操作时间不得超过4分钟）；
☆ 注意：颠倒时不能太剧烈，否则会有核DNA污染；如果Buffer S2因温度过低有SDS沉淀析出，可将其放置55~60C水溶锅中适当加热至澄清后再用。
1.抽提质粒的原理是什么？
碱裂解法

2. Buffer S2是什么？主要组分是什么？
0.2 N NaOH / 1% SDS
SDS：十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS），是洗洁精的主要成分。常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。

3.Buffer S2的功能是什么？
NaOH：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解。用了不新鲜的NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
4.加入Buffer S2为何时间不能太久，动作要轻柔？
第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

质粒抽提流程详解——中和
加入400ul Buffer S3，剧烈颠倒5~10次，使之充分中和，同时将大块白色沉淀振成小块，便于离心。
在约13600转/min的速度下离心沉淀12分钟，如有因沉淀不完全引起的白色絮状物质，可重复振荡离心直至沉淀完全。
1. Buffer S3是什么？主要组分是什么？
3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸

2.加入Buffer S3后出现的白色沉淀是什么？&3.Buffer S3的功能是什么？
每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，与此同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

2 M的醋酸的作用是什么？
是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

质粒抽提流程详解——纯化
将上步离心上清液用移液器转移到吸附柱上，在约10500转/min的速度下离心1分钟。
注意：不要把沉淀物转移到吸附柱里，1个样品使用1个枪头。

为何离心上清液经离心后，质粒DNA就被吸附到膜上？
在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。

质粒抽提流程详解——洗涤脱盐
取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，加入500ul Wash Solution到柱子中，高速离心（10,000rpm)30秒。
重复上述步骤一次。
取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，最大速度离心2分钟
使用Wash Solution要进行两次洗涤，目的是使残留的蛋白、盐离子等杂质更充分的被去除，保证硅胶膜上吸附的DNA尽量纯。

质粒抽提流程详解——产物回收
将DNA吸附柱移入新的1.5ml离心管中，在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 预热无菌双蒸水，室温放置2分钟后12，000rpm离心1分钟，离心管底即为质粒DNA。

㈣ 空气净化器具体有什么作用

空气净化器作用可大了，营造一个健康的室内环境肯定是有用的咯。比如家里养宠物的，总会有皮毛和小细菌。再比如家具、油漆什么的散发出来的甲醛，对健康可是危害很大的。我家用的是三星等离子空气净化器 MPI（AC-505CMAGA/SC） 系列，看中的就是三星独创的 SPi杀菌技术，是通过医学机构认证的，信得过。另外它的三重高效过滤器能过滤灰尘、动物皮毛、甲醛等有害物质。其中的一个 DNA 除臭过滤器更是能吸附致癌物质。家里用到现在，一直觉得好，整个环境都觉得舒适了很多，你说有用不？嘿嘿

㈤ 生物安全柜的超高效过滤网怎样定期检查有什么要求

生物安全柜高效过滤器检漏方法

随着生物技术的深入研究和其应用领域的不断扩大，生物安全越来越受到高度重视。由于生物技术的操作处理对象都是微生物、活细胞之类的有机体，或者是它们的重组体、变异体，在对其试验研究的各环节中，既有可以治疗疾病、改善生活、治理环境的积极作用，也存在着可能引发传染疾病、危害操作人员健康以至影响环境的消极因素。特别是在基因工程的实验研究中，存在着难以预知的潜在危害。因此，评价危害程度， 研究控制方案、设计防范措施，制定管理法规就显得非常重要。生物安全的关键是既要控制具有潜在危害的操作对象“由内向外地对周围环境释放，又要控制外界环境的有害因子“ 由外向内地对操作对象的入侵，因此，生物安全防护系统直接关系到周围环境及操作人员的安全。

１ 生物安全防护措施

１．１ 屏障控制

为了达到生物安全的目的，除了通过生物控制及严格操作技术、高度重视安全教育外，更为常用的方法是精心设计防护设备和实验设施，对生物危害采用封闭设备和隔离设施组成的屏障来控制，使操作人员和周围环境得到更加完善的保护。在生物安全实验室里设有一级屏障和二级屏障两道防线（确保实验人员的 安全、实验室周围环境的安全及实验对象对环镜的要求），一级屏障（生物安全柜，带有罩壳的离心机，超声振荡器等）发挥着主要的屏障作用，保护操作人员。二级屏障（ 整个实验室的壁、地坪、天花板等建筑构件和净化系统设施） 是一级屏障的外围设施， 能够在一级屏障失效或其外部发生意外时， 使其他的实验室及周围人群不致暴露于释放的实验材料之中而受到保护［１］。

１．２ 排风系统的作用

实验室二级屏障是通过送、排风的有效控制，发挥其安全保护作用，其安全的核心措施是通过排风保持负压，保证周围环境不受染污。当室内有致病因子泄漏时，排风高效过滤器就起着至关重要的作用，若高效过滤器泄漏，致病因子将随排风逸到室外，对室外环境造成巨大的污染，后果非常严重［２］。

２ 排风高效过滤器检漏

２．１ 检漏方法的可行性

在 ２００４ 年 ８ 月 ３ 日发布的《 生物安全实验室建筑技术规范》ＧＢ５０３４６－２００４（以下简称《 规范》）中要求：“ ５．３．２ 三级和四级生物安全实验室的排风必须经过高效过滤器过滤后排放，高效过滤器的效率不应低于现行国家标准《 高效空气过滤器》ＧＢ１３５５４中的 Ｂ 类［２］。《 规范》条文说明：“ ５．３．８ 由于排风是安全措施的核心， 如果排风过滤器有漏泄，就不能把住这道关，不仅排风形同虚设，而且更加危险，以致于此安全实验室也形同虚设了。所以，如果不能确认排风过滤器不漏，则此实验室不能启用［２］。……可见对排风高效过滤器的检漏的重要性，这是关系到实验室能否启用的关键。所以在《 规范》中，第 １０．１．６ 条规定“ 高效过滤器应按表：１０．１．６ 的要求进行检漏和评价［２］。

㈥ 初、中、高效过滤器净化等级和相应的作用

初效自过滤器介绍和作用

初效过滤器是空调系统的初级过滤，主要用于过滤 5μm 以上尘埃粒子。初效过滤器有板式、折叠式、袋式三种样式。

初效过滤器介绍和作用

中效过滤器主要用于中央空调通风系统中级过滤、制药、医院、电子、食品、等工业净化中；还可做为高效过滤的前端过滤，以减少高效过虑的负荷，延长其使用寿命；

迎风面大，空尘量大、风速低，被认为是最好的中效过滤器结构。

初效过滤器介绍和作用

高效过滤器主要用于捕集0.5um以上的颗粒灰尘及各种悬浮物，作为各种过滤系统的末端过滤。

初效、中效、高效过滤器作用的区别

1.精度不同：高效过滤器精度最高，初效过滤器精度最低；

2.安装位置不同：过滤器以“先粗后精”原则组合配置，顺序不能颠倒。初效过滤器在最前面，中效过滤器在中间，高效过滤器在最后面。

㈦ 急求！！DNA测序的问题

DNA测序技术
DNA sequencing technology
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
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二、材料
待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。
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三、设备
高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。
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四、试剂
（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。
（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。
（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步骤
：
成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：
（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。
（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。
（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。
（一）测序反应：
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液 5ml
引物 4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2 O 至终体积 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数
计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数
3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。
模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
（二）、 测序凝胶板的制备
1、玻璃板的处理：
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
(2)、长玻璃板的处理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。
2、凝胶的制备：
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。
凝胶终浓度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
（三）电泳：
1、预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
[注意]
（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2、样品的制备：
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3、上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
[注意]
1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
（四）、 测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

㈧ 洁净区高效过滤器接住什么,孔径多少,能截留菌吗

高效过滤器有溶菌酶空气过滤器，这个是滤纸生产的时候直接的图层。高效过滤器的最易穿透粒径是0.3微米，超高效的最易穿透粒径是0.12微米。。。且根据其过滤等级不同拦截率也不同。
高效过滤器的孔径多少这个没办法计算，高效过滤器一般是采用玻璃纤维的，就是把玻璃抽丝用胶粘合成一起的，测试的时候只是测试其过滤率。就是所说的等级。
你要是有啥问题可以直接给我发私信，我就是做空气过滤器销售的

㈨ DNA测序的测序技术

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
一、准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 。
12. 模板抑制试剂(TSR) 。
13. 10×电泳缓冲液 。
14. 全自动DNA测序仪。
15. PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待测的质粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl
待测DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
灭菌去离子水 2 μl 2 μl
总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。
3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
五、上机操作 1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
六、序列分析 仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
七、仪器清洗 测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
八、计算
1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。
2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03～2pmol模板DNA，随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
一、试剂准备
1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
3. 10%过硫酸铵，0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，定容至5 ml，应新配新用。
4. 10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
5. TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
8. 染色溶液：硝酸银2 g，甲醛3 ml，溶于2升超纯水中备用。
9. 显影溶液：60 g碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、测序反应
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（约20 μl）矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA ：2.1 pmol
5×测序缓冲液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
无菌ddH2O 至终体积16 ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf（+）对照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×测序缓冲液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以【注意】中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
【注意】
（1）测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200 bp（PCR产物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋质粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
（2）计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数
计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n为模板碱基对数
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n为模板碱基数
（3）为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟，然后： 95℃ 30秒（变性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分钟（延伸）。
模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟，然后：95℃ 30秒（变性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
三、测序凝胶板的制备
1. 玻璃板的处理
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高（棕色）。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鲜的粘合溶液。
② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板，整个板面都必须擦拭。
③ 4～5分钟后，用95%乙醇单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程，每次均须换用干净的纸，除去多余的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷，使凝胶不能很好地粘附。
② 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的，否则将导致凝胶撕裂。
（2）长玻璃板的处理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
② 5～10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。
2. 凝胶的制备
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%～8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2 ml，并用0.45 mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4～6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
（3）胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
四、电泳
1. 预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30 V/cm的电压预电泳20～30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
【注意】
① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2. 样品的制备
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1～3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3. 上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40～60 V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55 cm长，0.2 mm厚的凝胶板，在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
【注意】
① 上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
② 一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
五、测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10～20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影
（1）在显影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸钠溶液（400 μl）以完成显影液的配制。
（2）从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5～10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。
（3）立刻将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2～3分钟或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
【注意】
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响
① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。
② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可获得较好的结果。
③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4～6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
⑤ 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10～12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
六、EDF胶片显影
使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶（胶面向上）置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20～40秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程：
（1） 在Kodak GBX显影液中显影1～5分钟；
（2） 水洗1分钟；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分钟；
（4）水洗1分钟。
【注意】
① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。
② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。 “鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。
二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
五、对阳性克隆（含1kbp～2kbpInsert）进行DNA测序。
六、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。