蛋白质离子交换技术

A. 离子交换过程的5个步骤

离子交换过程归纳为如下几个过程1.水中离子在水溶液中向树脂表面扩散2.水中离子进入树脂颗粒的交联网孔，并进行扩散3.水中离子与树脂交换基团接触，发生复分解反应，进行离子交换4.被交换下来的离子，在树脂的交联网孔内向树脂表面扩散5.被交换下来的离子，向水溶液中扩散影响交换的主要因素有流速、原料液浓度、温度等。流速原料液的流速实际上反映了达到反应平衡的时间，在交换过程中，离子进行扩散—交换—扩散一系列步骤，有效地控制流速很重要。一般，交换液流速大，离子的透析量就高，未来及交换而通过树脂层流失的量增多。因此，应根据交换容量等选择适宜的流速。原料液浓度树脂中可交换的离子与溶液中同性离子既有可能进行交换，也有可能相斥，液相离子浓度高，树脂接触机会多，较易进入树脂网孔内，液相浓度低，树脂交换容量大时，则相反。但液相离子浓度过高，将引起树脂表面及内部交联网孔收缩，也会影响离子进入网孔。实验证明，在流速一定时，溶液浓度越高，溶质的流失量液越大。温度温度越提高，离子的热运动越剧烈。单位时间碰撞次数增加，可加快反应速率。但温度太高，离子的吸附强度会降低，甚至还会影响树脂的热稳定性，经济上不利，实际生产中采用室温操作较宜。

赞同0
暂无评论

B. 离子交换色谱法是蛋白质纯化技术中的一种吗

是的，蛋复白质纯化技术分为制电泳和色谱法两种。离子交换色谱法是色谱法的一种，所以也是蛋白质纯化技术中的一种。其实在伯乐生命医学上有很详细的介绍，蛋白质纯化技术就是为了获得的蛋白质去除杂质而是用的各种方法，并且根据不同的蛋白质采用的方法也有所不同，蛋白质纯化的工作是较为复杂的。

C. 蛋白质分离方法有哪些,它们的特点各是什么

1.根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白
质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离.超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程.这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开.它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法.当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度.密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低.蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一.凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等.在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1].凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7].
2.根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等.但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的.常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等.
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法.每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解.因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质.王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%.李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来.等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取.李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8.他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%.另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12].
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析.应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10].盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产.由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性.为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13].
有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质.例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14].由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性.因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决.对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液.冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15].
萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质.双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取.此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高.对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎.目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中.采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16].
反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的.反胶团是当表面活性剂
在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体.这种方法的优点是萃取过程中蛋
白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护.程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质.
3.根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类.
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这
种现象称为电泳.聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质.它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少.等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定.利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的.在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带.孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用.结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大.
离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法.离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成.带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂.离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化.当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同.阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来.反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来.李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯.另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法.它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高.应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件.近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20].亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21].范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%.该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定.

D. 离子交换层析名词解释

解释：

离子交换层析(ion-exchange chromatography,IEC) 是在生物大分子提纯中得到最广泛应用的方法之一。

离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维

离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维

离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维

E. 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质

离子交换柱层析法的核心在于不同的蛋白质的等电点不同
所以说，利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质其实就是利用不同蛋白质不同的等电点来分离。比如目的蛋白等电点是5，那么在环境pH为8.0的情况下，目的蛋白可以结合阴离子交换层析，而杂蛋白可能不能结合或者结合能力比目的蛋白弱。通过不同的盐浓度的洗脱让结合能力不同的蛋白在不同的组分被洗脱出来，最终完成对目的蛋白和杂蛋白的分离。

F. 蛋白质的分离纯化技术有哪些

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4 度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0 度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱和溶液为 4.1M，即 767 克/升；0 度时饱和溶解度为 3.9M，即 676 克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常
用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质
从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

如果你有蛋白质纯化方面的技术服务需求，可以来百替生物看看，网址是：http://www.100biotech.com/index.php

G. 蛋白质的分离纯化技术有哪些

常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等
离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液pH。pH小于pI时蛋白质带正电，pH大于pI时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。
亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。如镍柱中Ni可以与His标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。
电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。

H. 离子交换层析可以用于哪些蛋白质的分离

可以分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。
阳离子交换层析，使用含回有酸性基团的阳离子答交换树脂等，可以结合待层析液中的阳离子，因而洗脱顺序是，正电荷越多结合越紧密洗脱越晚。
阴离子交换层析则使用含有碱性基团的交换树脂，结合溶液中的含有阴离子基团的分子，因而负电荷越多结合越紧密，洗脱越晚。

I. 为什么说离子交换色谱法是分离蛋白质的最佳方法

它是根据蛋白质的组成物质氨基酸的物理性质（基于氨基酸电荷行为）为分离基础的方法。相对透析和超过滤及凝胶过滤来说，可以针对多种蛋白质中的某一种（前提是知道蛋白质的氨基酸组成及其离子交换树脂的亲和度及洗脱强度）进行分离。（而透析和超过滤还有凝胶过滤方法更大的取决于相对分子质量及其结构 分离出的单一蛋白质纯度相对要低 并且凝胶过滤要求凝胶对要求组分不能有吸附作用 适用性较低 ） 相对盐溶和盐析来说，分离单一蛋白质的纯度要高，且更好的保留其天然理化性（盐溶要求蛋白质分子吸附某一盐离子从而改变其溶解性 但有些蛋白质吸附某些盐离子后其蛋白质构象及理化性会发生改变）。 相对有机溶剂分级分离法，更好的保留其天然理化性（有机溶剂分类法易造成蛋白质不可逆变形 且适用范围窄） 相对凝胶电泳和等电聚焦来说 更易于实现大量制备分离 且不改变蛋白质结构和功能（电泳会影响蛋白质结构 且操作繁琐 成本高） 相对亲和层析来说 它更加易于实现且成本低廉效果也不错（亲和层析需要制备其配体并与载体交联 因而制备难且成本较高）
PS: 最好的分离方法不是例子交换色谱法 而是高效液相色谱法 相对离子交换色谱来说有着更高的效率、更高的分辨率和过柱速度