氨基酸分析仪阳离子交换色谱

A. 氨基酸分析仪的工作原理是什么

不同的氨基酸结构不同,可通过红外光谱,核磁共振氢谱等方法识别各个酸特定结构,江苏高二化学里有.

B. 氨基酸自动分析仪测定蛋白质中氨基酸组成的原理

采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通HPLC相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化（例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等）
通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度（即最低检测限）比HPLC柱前衍生方法稍低以外（HPLC：<0.5pmol；氨基酸分析仪：<10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。

C. 氨基酸分析仪的介绍

氨基酸分析仪是一种分析仪器，采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。

D. 氨基酸分析法的方法分类

本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25&micro;mol/ml。
试剂 （1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液200μl，置一2ml塑料离心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混匀，精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1小时，加0.8ml正己烷，剧烈振摇，放置10min，精密取下层溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液200μl，自“置一2ml塑料离心管中”起同法测定。 本法系根据氨基酸与6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）反应，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为2.5～200nmol/ml。
试剂 （1）流动相A 取醋酸铵10.8g或无水醋酸钠11.5g，加水900ml溶解，用磷酸调pH至5.0，然后加水至1000 ml。
（2）流动相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至8.8，然后加水稀释至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.4ml；柱温为37℃；检测波长为248nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 测定法 精密量取对照品溶液10μl，置一直径为0.4cm、高度为5cm的小试管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 70μl，在涡旋混匀器上混匀，精密加入AQC溶液20μl，混匀，精密量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液10μl，自“置一直径为0.4cm”起同法测定。 本法系根据一级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛（OPA）反应，生成OPA-氨基酸；反应完毕后，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～2.5&micro;mol/ml。
试剂 （1）流动相A 称取醋酸钠7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氢呋喃24ml，混匀，用2%醋酸调pH至7.2。
（2）流动相B 称取醋酸钠10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸调pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至10.4，然后加水稀释至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巯基丙酸125μl ，混匀 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×150mm， 5μm）；柱温为40℃；检测波长为338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度及流速如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 测定法 精密量取对照品溶液50μl，置一1.5ml塑料离心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2) 250μl，混匀，精密加OPA衍生剂50μl，混匀，放置30秒，精密加入FMOC衍生剂50μl，混匀，精密量取4μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液50μl，自“置一1.5ml塑料离心管中”起同法测定。
附注：1、由于OPA-氨基酸不稳定，因此衍生后应立即进行分离测定。
2、本方法的衍生过程也可由自动进样器完成。 本法系根据氨基酸与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸经反相高效液相色谱分离后采用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯属易爆、剧毒物质，有强致癌性，且该法对色谱柱要求较高，易损坏色谱柱，衍生试剂水解生成的2，4-二硝基苯易干扰丝氨酸的测定。除另有规定外，一般不宜采用本法。
试剂 （1）流动相A） 0.05mol/L醋酸钠溶液(取 4.1g无水醋酸钠，加水800ml溶解，加二甲基甲酰胺10ml，用稀醋酸调pH至6.4，用水稀释至1000 ml)。
（2）流动相B 流动相A-乙腈（1：1）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为360nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化试剂（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀释至100ml）1ml，混匀，在60℃水浴中反应 1小时，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法测定。 本法系根据氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后，与茚三酮反应，一级氨基酸生成在570nm处具有最大吸收的紫色化合物，二级氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黄色化合物，分别在570nm和440nm下检测上述反应产物，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为20～500 pmol。
试剂 （1）流动相A 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸1.5ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至3.0。
（2）流动相B 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸0.7ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至4.3。
（3）流动相C 取氯化钠5g，无水柠檬酸钠1.9g，苯酚0.1g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至6.0。
（4） 色谱柱再生溶液 取氢氧化钠0.8g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至13。
（5）柱后衍生试剂 取茚三酮18g，茚氮兰0.7g，加76.7%二甲基亚砜－0.7二水合醋酸锂－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮气下混合至少3小时。
（6）样品缓冲液 2%无水柠檬酸钠-1%盐酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物为填充剂（4.0×120mm， 7.5μm）；流动相流速为每小时14.0ml；柱后衍生试剂得流速为每分钟7ml，反应器温度为135℃；检测波长为440nm(一级氨基酸)，570nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：开始时用流动相A平衡色谱柱，在25分钟流动相的组成变为100%流动相B，在37分钟，流动相组成变为100%流动相C，在75min，最后一个氨基酸被洗脱后，用色谱柱再生溶液再生色谱柱1分钟。柱温程序如下：开始时柱温48℃，11.5分钟后，以每分钟3℃的速率升至65℃，约35分钟后，以每分钟3℃的速率升至77℃，最后在约52分钟后，以每分钟3℃的速率降至77℃。
测定法 精密量取氨基酸对照品溶液适量，注入氨基酸分析仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液适量，同法测定。
附注：不同品牌的氨基酸分析仪，应根据仪器的要求，对流动相、色谱柱再生溶液、衍生试剂、缓冲液和洗脱梯度作适当调整。

E. 氨基酸分析仪的优缺点

采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通hplc相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化（例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等）
通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和ph值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度（即最低检测限）比hplc柱前衍生方法稍低以外（hplc：<0.5pmol；氨基酸分析仪：<10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。

F. 离子交换色谱产生的信号值是什么

离子交换来色谱中的固源定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子。这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。

G. 氨基酸分析仪的辨别

1、原理。基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。此类方法由Stein和Moore两人1958年发明，并于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指标。满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到1.2作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。
3、指标的真实性。有些厂家只标出个别氨基酸的指标如Asp或Arg，或只用平均数据替代全部数据等等，而仪器性能好，经营信誉较高的厂家就会标出全部氨基酸的指标供用户参考。
4、仪器的可靠性。如果仪器今天堵了、明天漏了，用户不仅要付出大量人力财力，分析结果的可信度也将大打折扣。
5、仪器的运行成本。例如是否可以使用国产试剂、柱子寿命（以多少次进样计算、而不以多少年计算）等。
6、仪器设计是否有利于氨基酸分析。例如是否有惰性气体保护（茚三酮极易被氧化）、是否提供在线脱气、是否提供溶液和样品的制冷控制等。
7、售后服务。分析过程中遇到困难是在所难免，厂家必须能够快速响应、尽快解决问题。另外，常用备件的价格也是一个重要因素，因为用户在购买前一般难以注意到售后的问题，而很多厂家也没有公示自己的常用备件价格，这就为将来的使用埋下了隐患，事实上，也的确有很多仪器在出现一些看似微小的故障之后，就因为维修费用太高而被“束之高阁”。
我想，您要是按照以上的标准去选择氨基酸分析仪的话，一定能够选到满意的仪器，成为您工作中得力的助手。

H. 如何用液相色谱仪测氨基酸

反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸
氨基酸是烟草中的一类重要化学物质，在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作，二十世纪60年代以来，国内外在这方面做了大量的工作[1-5]。
植物游离氨基酸样品的制备，国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同。据文献报道[6-7]，盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法。本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究，确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法。提取、纯化后的样品，采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定。该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定，且得到较好的定性定量结果。
1 实验
1.1 仪器
Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。
1.2 试剂
正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；
醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；
氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；
苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。
1.3 样品处理
将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。
样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。
流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。
流速：0.45ml/min
柱温：40℃
紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：见表1
表1 流动相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。
1.6 内标法定量
准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的比较
氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。
2.2 乙醇浓度的选择
选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。

2.3 不同纯化方法的确定
在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。
2.4 色谱分离
2.5 线性范围及标准曲线
分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。
表2 氨基酸的标准曲线
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 线性方程 相关系数
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重现性实验
取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。
2.7 回收率实验
用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 样品分析
利用该方法对不同等级的烟叶中游离氨基酸的含量进行了分析，结果见表4。从表中可以看出，在所分析的样品中，烤烟烟叶中含量最高的氨基酸是Pro，白肋烟烟叶中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋烟烟叶中氨基酸的含量高于烤烟烟叶；相同等级的烤烟烟叶，云南烟叶中的氨基酸含量高于其它产区。
表4 不同等级烟叶中游离氨基酸的含量（mg/g烟样）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 云南烤烟C1F 云南烤烟C2F 云南烤烟C1L 云南烤烟B1F 云南烤烟B2F 福建烤烟B1F 福建烤烟C1F 四川烤烟C1F 四川烤烟B1F 贵州烤烟C1F 贵州烤烟B1F 贵州烤烟C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
总量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 结论
本烟叶中游离氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作为萃取溶剂，阳离子交换树脂对提取液进行纯化，能够最大程度地提取烟叶中的游离氨基酸并较好地去除了影响氨基酸测定的杂质，使色谱图中杂质峰较少；OPA、FMOC联和柱前衍生使带氨基和亚氨基基团的氨基酸同时得到测定；良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得到较好的分离，并使定量结果更加可靠。

I. 氨基酸分析仪的色谱柱是什么填料的寿命大概能有多久能自己装填吗

您好来，我是德国曼默博尔公司自的工程师。
氨基酸分析的色谱柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合后磺化成的磺酸型强酸性阳离子交换树脂。
其实，色谱柱寿命主要看自己使用时候保护的怎么样：包括样品前处理是否规范，维护保养是否充分等。一般注意点使用的话，保证柱效的情况下，寿命能保证在1万-2万针左右，多的话也有可能，看你怎么用了。有的厂家会吹嘘能到6万针，简单计算下氨基酸分析一个样大概得1小时左右，除去维护时间，一天最多跑个20针，一年也就6000针左右，10年才能跑完6万针，到时候仪器报废没报废都不知道，别说色谱柱了。
色谱柱的装填是非常需要经验和技巧的活儿，而且装色谱柱得需要非常专业的色谱柱装柱机。比如装色谱柱的时候得用恒压泵装，一般实验室仪器都配置的是恒流泵，恒流泵装出来的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、匀浆等都非常需要经验，要是自己装估计很难，一般得找专业的色谱柱工程师装填最好。
希望对您有帮助，记得给分

J. 氨基酸用离子交换柱,色谱柱为什么需要平衡啊

如果你用的是一般的液相色谱仪,需要很长的时间平衡柱子和系统,因为离子交换柱对流动相中的离子很敏感,一般的液相色谱仪内壁是金属的,多会产生离子或静电荷,对分析造成干扰.推荐用离子色谱仪,或氨基酸分析仪,不过也要平衡一定的时间