『壹』 不可逆性抑制剂只是不能用透析,超滤等方法去除,可以用其他方法使酶恢复活性吗
酶如果失去活性的话是不能恢复的吧,尤其是生物酶。
『贰』 如何利用透析法进行脱盐浓缩蛋白
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。
(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex
ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。
(三)根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)
(四)根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法
亲和层析法(aflinity
chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)
和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的:
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流;或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同,必须根据工作需要来选用。另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值:
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM-300300,000140
XM-200100,00055
XM-5050,00030
PM-30 30,00022
UM-2020,00018
PM-1010,00015
UM-21,00012
UM05500 10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍。
『叁』 费森尤斯血液透析机4008s的操作流程
按照置换液泵屏幕显示进行操作(不能提前操作)
自检状态屏幕显示(I1-test in proqyess) 自检结束,屏幕显示; (1)Select HD?HDF?HF?(选择HD?HDF?HF?)按压▲或▼键选择HDF或HF, 按压Enter确认;第一次。
(2)Connect sub tubing?(连接置换液管路?)按压Enter键确认;第二次。
(3)Please wait(请等待)安装安全导管前必须无菌操作,操作者的手不能 触摸安全导管接头防止污染。
(4)Open sub port!(打开置换液口),拔出置换液口锁顺时针旋转90度。(蓝 色旋钮)
(5)Open pump door!(打开置换液泵的泵门)
(6)Connect sub tubing!(连接安全导管),将安全导管插入置换液口内,管 路固定在夹子内,将置换液口锁再顺时针旋转90度,(蓝色旋钮)压住安 全导管。(左侧管装入)
(7)Insert sub tubing!(插入安全导管),按住置换液泵Start/ Stop键, 直至管路被完全滚动进中
(8)Open rinse port!(打开冲洗口),拔出冲洗口锁并顺时针旋转90度;(白 色旋钮,安装右侧管)
(9)Conneet rinse connector! (连接冲洗器插头),将冲洗器插入冲洗口内, 将冲洗口锁再顺时针旋转90度压住冲洗器;(白色旋钮)
(10)Priming blood line (预冲血路管)将静脉管路病人连接端与冲洗器 相连,动脉管路病人连接端与安全导管A、V相连。(红对红,安全导管的 红色接头与血路的动脉端红色接头连接;蓝色接头与血路管的动脉侧给液 口连接,血路管静脉侧与冲洗器连接,插入置换液泵排液口,透析器静脉 侧朝上,同时将透析机的透析液接头连接在透析器上,认真检查动脉压、 静脉压是否连接在监测器上、各个接头是否连接好、各个夹子是否打开; 准备预冲)
(11)启动血泵前先按压prime(预冲键)开始预冲;
(12)待管路全部冲满液体后,预冲量计时开始,一般1000ml-2000ml,屏幕显 示“RinseVol: ××ml UF Vol:××ml”按压Sta rt/Stop键停止 泵转。
(13)Terminate rinse?(停止冲洗)按压Enter键确认。
(14 )Remove rinse connector!(取出冲洗器插头),卸下冲洗器 插头,将冲 洗口锁复位,将动脉管路和静脉管路的病人连接端相连,安全导管连接 于动脉壶(前稀释)或静脉壶(后稀释)。
(15)Enter uF time! (设定透析时间、脱水速度、调整透析液的流量、按UF 透析菜单设定)。.
(16)Enter sub voIume(设定置换液量)准备连接病人前将肝素注射器连接在 透析机的肝素注射器架上,打开夹子。
(17)血透开始后,即打开UF键;调整血流量后,病人无不良反应, 可输入血滤量;先按容量键、再按箭头、机器默认50/min 、可调至70 -80/min ,同时总量自动算出,再按确认键,再按血滤键开关(蓝色) 选择好前或后稀释补液法将血滤给液口打开。(不能忘记)血滤开始。
『肆』 费森4008S血液透析滤过机更换细菌过滤器的程序
那支过滤器就是过滤反渗水和透析液混合液体的,双泵机才有另一支过滤器,是置换液过滤器。血透机的血路管都是可以通用的。进口和国产的都有。费森的消毒液也有国产的可以代替。
『伍』 费森4008s血液滤过机钠曲线怎么操作
摘要 超滤曲线的作用:1 避免透析后期低血压的发生。2 防止透析当中肌肉痉挛的发生
『陆』 如何为血液透析病人设定超滤量
理想状态就抄是,让患者体重达到干体重,清除掉全部的多余水分。
但,有一些患者透析间期体重增长控制的不好,体重增加过多,如果想要全部清除,必然会导致血容量下降型低血压,针对这样的患者,就只能增加透析次数,控制每次超滤量。
『柒』 超滤与透析的区别
一、原理不同
超滤:超滤是血液通过机器泵或者血压流经体外滤器,在人工肾小球跨膜压的作用下,液体从压力高的一侧向压力低的一侧移动,通过对流的方式获得超滤液。
透析:透析依靠半透膜进行弥散和渗透。半透膜两侧的溶质浓度差就是驱动溶质移动的原动力,溶质从浓度高的一侧通过平衡膜向浓度低的一侧(弥散作用),水分子移向渗透浓度高的一侧(渗透作用)。
二、使用的膜不同
超滤:超滤膜的孔径在0.05 um–1 nm之间,主要用于截留去除水中的悬浮物、胶体、微粒、细菌和病毒等大分子物质。
透析:透析所使用的半透膜厚度为10-20微米,膜上的孔径平均为3纳米,所以只允许分子量为1.5万以下的小分子和部分中分子物质通过,而分子量大于3.5万的大分子物质不能通过。
三、装置不同
超滤:超滤装置一般由若干超滤组件构成。
透析:透析所使用的装置是血液透析器。
(7)费森透析机停超滤方法扩展阅读
超滤的操作影响因素:料液流速、操作压力、温度、运行周期、进料浓度、料液的与处理、膜的清洗。
操作温度主要取决于所处理的物料的化学、物理性质。由于高温可降低料液的黏度,增加传质效率,提高透过通量,因此应在允许的最高温度下进行操作。
超滤膜透过通量与操作压力的关系取决于膜和凝胶层的性质。超滤过程为凝胶化模型,膜透过通量与压力无关,这时的通量称为临界透过通量。
『捌』 尿毒症透析治疗的方法有几种
作为患者到底选择哪种透析方法比较好呢?其实,只要搞清楚这两种方法的不同,你才能得到正确的选择。两种方法都可以使患者症状消失,精神和体力得到恢复,血生化恢复正常,可以基本正常工作。
血液透析,是一种易行、应用广泛、较安全的血液净化方法。血液透析包括溶质的移动和水的移动,即血液和透析液在透析器也就是人工肾内借半透膜接触和浓度梯度进行物质交换,使血液中的代谢废物和过多的电解质向透析液移动。
腹膜透析,是指利用腹膜作为半渗透膜,利用重力将配制好的透析液通过导管灌入患者的腹膜腔,这样,在腹膜的两侧就形成了溶质的浓度梯度差,高浓度一侧的溶质向低浓度一侧移动;而水分则从低渗一侧向高渗一侧移动,通过腹腔透析液不断地更换,从而达到清除体内代谢物、有毒物质及纠正水、电解质平衡紊乱的目的。
目前不手术、不透析治疗尿毒症的方法属生物细胞移植疗法,我院已经治愈32000多例患者。祝您早日康复。
『玖』 德国费森尤斯CRRT MultiFiltrate 床旁血滤机怎么操作(具体操作步骤)和常见报警处理解决办法
1. 启动
1.1 连接电源
1.2 打开机器背面开关键
1.3 打开操作面板开关键(按下约3秒钟)
2. 自检测
2.1 核对机器软件版本
2.2 核对开始条件是否满足
3. 功能检测
3.1 检查显示序号是否完整
3.2 检查机器是否有声音报警响应
4. 选择治疗模式
4.1 选择“选择新的治疗”或“继续原来的治疗”
4.2 选择“CVVH”治疗模式
5. 安装管路系统
5.1 按照指示安装盒式动静脉管路系统
5.2 按照指示安装置换液管路系统
5.3 按照指示安装肝素注射器
6. 预充管路系统(后置换连接方式)
7. 冲洗管路系统
8. 输入治疗参数
9. 超滤冲洗
10. 再循环/等待病人
11. 结束准备程序,选择“前稀释”或“后稀释”
12. 连接患者
13. 开始治疗,调整治疗参数
14. 完成治疗
14.1 选择“结束治疗”并“确认”
14.2 关血泵
14.3 动脉端与患者断开,接生理盐水,开始回输
14.5 断开与病人的连接,移开管路系统
14.6 记录治疗历史
15. 关机,清洁机器
『拾』 腹膜透析患者刚刚开始透析,不太明白超滤量怎么算,比如我中午灌入1330毫升,晚上流出1300毫升
腹膜透析超滤量是透出量减去透入量。因为没有描述透入量,不能准确算出超滤量。一般常规透入量是2000ml,故超滤量是500ml。
以慢性肾衰竭的患者为例。如果患者有腹膜透析适应证,没有禁忌证,则可以选择腹膜透析治疗。专科医生将向患者或监护人无偏见地介绍血液透析、腹膜透析、肾移植等肾脏替代治疗方法的治疗方式、原理和各自的优缺点并给予中肯的治疗建议。除医疗方面原因外,可由患者自主选择透析方式。
需要接受透析治疗的情况:
透析疗法是利用半渗透膜来去除血液中的代谢废物和多余水分并维持酸碱平衡的一种治疗方法。
一般来说,患者血肌酐浓度超过700,或者肾小球滤过率在15ml/min/1.73m2以下时,如果出现了水负荷过重(比如有水肿或腹胀的症状)、严重的营养不良、药物难以纠正的高钾血症、高磷血症等,就需要做好随时做透析的准备。