抗体阳离子交换常用的缓冲液

1. 生物制药纯化段用哪些化学品

1、抗体：（1）澄清目前我们最常用的的技术方法是离心和深层过滤。在实验室级别的样品制备和纯化，从效率和经济成本方面考虑，通常会使用离心的方法去除细胞和大部分颗粒碎片。在大规模的情况下一般使用深层过滤，相比较离心，深层过滤在大规模发酵料液的处理过程中效率更高，对设备要求较低（与离心机比较），并且目前市面上复合材料的深层过滤器具有去除HCP和DNA等杂质的效果。因此不同情况下应选择不同的方案。（2）亲和深层过滤之后，在绝大部分情况下会使用亲和层析。亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。Protein A由于其与抗体Fc片段良好的特异亲和性，较高的纯化倍数，工艺的简易性而被用于大多数抗体纯化工艺中的捕获阶段。亲和层析的填料价格较为昂贵，因此亲和层析可能需要设计通过几次循环层析来捕获这一批产品的目标蛋白。在这里要考虑和平衡好时间长短和经济成本的影响。时间太长，对上样液中目标蛋白的稳定性不利；循环次数太低，填料需求量太大，生产成本会提高。（3）离子交换层析离子交换层析有阴离子层析和阳离子层析。依据蛋白的酸碱性，极性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对填料上的离子交换剂有不同的结合和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。这两种层析根据蛋白的特性来选择结合或者穿透模式进行纯化。其中，往往会有一个离子交换层析主要用来分离目标蛋白中的酸性、中性和碱性组份；另一个离子交换层析用于少量杂质，如：HCP、DNA、内毒素等物质的分离。（4）疏水层析疏水层析从分离纯化生命物质的机制来看，也属于吸附层析一类，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质进行分离。在某些单抗纯化的工艺中会用到疏水层析。疏水层析在去除多具体、DNA、HCP和内毒素等杂志方面都有很好的效果。但要注意的是，这种层析方法往往缓冲液条件比较极端（盐浓度很高，硫酸铵浓度甚至可以达到2摩尔）因此对一些蛋白可能会产生不利的影响。另外，由于疏水层析洗脱下的目标蛋白可能会含有较高的盐浓度，在超滤换液的过程中会需要更多的换液次数和体积。（5）超滤和换液超滤的原理：以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，；当料液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许小分子物质通过而成为透过液，而料液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对蛋白的纯化、分离和浓缩的目的。最后还可以通过不断置换蛋白液中的缓冲体，达到换液的效果。单抗的超滤除了选择超滤膜包之外，还可以选择中空纤维柱。但行业中基本都是选择超滤膜包。虽然两者各有优势，但却选择超滤膜包，其中很大的一个原因是超滤膜包的耐压能力比中空纤维强（超滤膜包8bar，中空纤维3bar），精纯后的单抗往往稳定性比较好，所以选择超滤膜包似乎更加合适。2、重组蛋白（1）菌体收集菌体收集一般有离心和中空纤维两种方法。离心收集菌体，一般会用管式离心机；中空纤维收集菌体则是通过中空纤维的过滤，进行菌体的收集。收集菌体我们往往首先想到的是离心，但是放大无疑是离心机的软肋。中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量（菌体发酵液）、高粘度（菌体裂解液）和剪切力敏感型样品（质粒），并且具有良好的线性放大能力。因此推荐选择中空纤维，具体见后面的菌体洗涤步骤的描述。在这一步如果是收集和洗涤大肠杆菌，推荐使用透过孔径为500、750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 内径的中空纤维（2）洗涤菌体菌体在收集之后，因为在过程中菌体和很多杂质都被一同收集了，所以之后有必要进行洗涤，把大量的颗粒、可溶或不可溶的杂质去除掉。这样可以减少在后续纯化中的杂质；另一方面，因为去除了大量的酶，因此对产品的活性也会有一定的保护作用。菌体洗涤主要有两种方法。第一种方法，前一步骤收集的菌体用合适的缓冲液把菌体混悬在洗涤的Tank中，进行洗涤。然后让菌体自然沉降，之后再置换菌体洗涤液混悬。以上步骤重复2~3次，之后收集沉降的菌体液，进行离心。第二种方法，中空纤维。如果菌体收集时使用的是离心法，则需要用合适的缓冲液把菌体混悬在洗涤的Tank中，之后一边搅拌防止菌体沉降，一边置换洗涤液。如果之前是用中空纤维收集的菌体，则可以在之前的设备上继续操作，置换和洗涤菌体。因此在大规模菌体收集和洗涤的应用中，我会优先选择中空纤维，一套设备多种用处。中空纤维无论在成本、能耗、人力、时间、场地等方面都有很大的优势。除此之外在粗纯的过程中，中空纤维还有出色的应用。（3）破菌破菌主流的方法有：高压匀浆机破菌 和 菌体裂解—碱裂解。高压匀浆机破菌：个人认为，高压匀浆机破军效率较低，对设备要求较高，破菌之前还要把菌体做相应比例的稀释和混悬，破菌过程中噪音大，能耗也较高。但其一直是比较成熟且可靠的破菌方法，一直在被行业使用。碱裂解：碱裂解法由于具有操作简便、重复性好等优点,已成为目前最为广泛应用的破菌方法，但是一些蛋白在碱裂解的过程中容易失活，因此要做评估和实验比较。除此之外还有使用细菌溶解酶破菌，如果使用这个方法，在产品的检测项目中要加入残留检测。（4）粗纯与单抗相比，微生物破菌后，其杂质负荷非常高，很难直接使用深层过滤的方法进行处理，所以粗纯方法很不相同。当破菌完成后，料液不推荐直接上色谱，因为杂质含量太高会影响层析的的分辨率，降低了目标蛋白的载量，并且还可能损害树脂的再生。粗纯可以用萃取的方法，如PEG沉淀、硫酸铵沉淀或硫酸钠沉淀等方法。如果目标蛋白是在沉淀中，则在沉淀之前还有必要进行离心去除微生物碎片。因此在规模越大的纯化中这种方法越难操作。我们推荐中空纤维进行粗纯，中空纤维还可以有效去除细胞碎片。之后再用更小孔径的中空纤维进行换液，可以有效去除RNA、色素和部分 HCP、HCD 等杂质，以减少层析阶段的负荷并且可以浓缩样品，减小上样的体积和时间。注意：在菌体收集、洗涤、粗纯的过程中，超滤膜包不可替代中空纤维。虽然两者都是切向流，但两者的结构设计还是有很大的不同，粘稠的料液容易堵死超滤膜包。相比而言，中空纤维的设计更适合处理高粘度且固体含量高的样品。（5）精纯如果目标蛋白本身带有标签，则可以考虑使用亲和填料。比如带有His标签的蛋白，我们可以用Ni亲和填料进行纯化。但如果蛋白不带标签，则可以考虑使用离子交换、疏水层析以及其他层析方式进行精纯。精纯的层析往往需要2步甚至3步，这里不详述。在这里我们要注意的一点是：重组蛋白与单抗相比，往往不太稳定，容易失活和沉降，在开发过程中要尤为注意到这点。（6）超滤超滤参考单抗。3、病毒样颗粒：病毒样颗粒（VLP）是与病毒极为相似的分子，但由于它们不含病毒遗传物质而具有非传染性。它们可以是天然存在的，也可以通过病毒结构蛋白的单独表达而合成，然后可以自组装成病毒样结构。来自不同病毒的衣壳蛋白的组合可用于创建重组VLP。这几年大家谈论最多的病毒样颗粒产品有HPV疫苗，除此之外，还有HFMV等疫苗。VLP可以在多种细胞培养系统中产生，包括细菌，哺乳动物细胞系，昆虫细胞系，酵母和植物细胞。我们就以酵母胞内表达的产品为例，因为酵母胞内表达的产品通常纯化比较具有挑战性。如果要了解动物细胞表达的纯化方法，可以参考后面“慢病毒纯化”的内容。（1）菌体收集、洗涤菌体、破菌、粗纯这几部分可以参照前面重组蛋白纯化的方法，但在这要注意的是，中空纤维的选择因菌体的不同，选型要有所调整。举个例子：果是收集和洗涤的是大肠杆菌，推荐使用透过孔径为500、750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 内径的中空纤维，如果微生物是酵母，则推荐使用通过孔径为0.45 um、0.65 um或1 um的中空纤维进行菌体的收集和清洗。（2）精纯VLP与单抗和重组蛋白相比，其分子量要大很多，显微镜下一般在20~100纳米之间，它的稳定性较差。纯化过程中应尽量选择温和的条件，否则VLP容易出现在形状不规则、不均一或残缺的情况。精纯一般有1~3个步层析和超滤换液组成（根据产品的质量要求而定）。常规的层析组合如下：离子交换层析：捕获VLP，一般离子交换层析对VLP的载量都不高（10mg/ml左右）。分子筛复合填料：如Core 700（根据VLP的大小进行选择），以穿透的模式进一步纯化。它比传统的分子筛纯化有着巨大的优势，第一，载量大。甚至可以一次性上样相当于10倍以上柱体积的样品。第二，它具有吸附小分子杂质的作用（根据填料型号不同，吸附杂质大小的上限也不同），可以进一步去除DNA、HCP、内毒素、VLP碎片等杂质。疏水层析：可以去除一些不规则或者聚集的VLP，以及其他微量杂质。但疏水层析条件比较剧烈，可能会对对产品有有着负面影响。（3）超滤与超滤膜包相比，中空纤维剪切力更低。VLP对剪切力的耐受力较低，建议使用剪切力小的中空纤维，起到降低对产品的负面影响。如果可以去掉超滤步骤则更好。4、慢病毒纯化目前慢病毒培养的的主流是贴壁细胞和悬浮细胞（动物细胞）。（1）澄清过滤无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，发酵液中都会存在一些细胞、颗粒和脂质体，因此有必要进行澄清过滤。慢病毒的澄清过滤一般不推荐使用深层过滤膜包，因为深层过滤膜包容易把病毒一同去除掉。可以尝试使用中空纤维或囊式滤器进行过滤，如：0.45μm孔径，收集透过液。之后的精纯可以根据产品的情况进行模块组合，一般有：浓缩、离子交换层析、分子筛，以上的模块组合不分先后，根据产品情况决定。最后超滤换液。下面我们阐述。浓缩或换液，有些公司的产品病毒表达量较低，或者产品中的培养基和者其他杂质很有必要在层析之前去掉，那么就有必要加入浓缩或换液这个步骤。用中空纤维把料液超滤浓缩，之后换液成下一步层析的上样缓冲溶液。慢病毒对剪切力的耐受力较低，使用超滤很容易降低病毒的收率，建议使用剪切力小的中空纤维，起到降低对产品的负面影响。离子交换层析，分子筛复合填料，可以参考之前VLP的描述。

2. 在对凝血因子fviii作离子交换层析时，所用缓冲液为什么要添加枸橼酸钠

柠檬酸钠在食品、饮料工业中用作风味剂、稳定剂；在医药工业中用作抗血凝剂、专化痰药和利尿药；在洗涤剂工属业中，可替代三聚磷酸钠作为无毒洗涤剂的助剂；在化学上是优良的螯合剂/络合剂,在工业上对柠檬酸钠的应用都是利用此一特性。还用于酿造、注射液、摄影药品和电镀等。
柠檬酸钠是目前最重要的柠檬酸盐，主要由淀粉类物质经发酵生成柠檬酸，再跟碱类物质中和而产生，具有以下优良性能：(1)安全无毒性能。由于制备柠檬酸钠的原料基本来源于粮食，因而绝对安全可靠，对人类健康不会产生危害。联合国粮农与世界卫生组织对其每日摄入量不作任何限制，可认为该品属于无毒品。（2）具有生物降解性。柠檬酸钠经自然界大量的水稀释后，部分变成柠檬酸，两者共存于同一体系中。

3. ph值测定常用的标准缓冲溶液有哪几种

草酸盐标准缓冲溶液
酒石酸盐标准缓冲溶液
苯二甲酸氢盐标准缓冲溶液
磷酸盐标准缓冲溶液
硼酸盐标准缓冲溶液
氢氧化钙标准缓冲溶液

4. 过离子交换柱时，pH梯度洗脱缓冲液一般用什么缓冲液

如果不限定纯化方法，可以考虑亲和层析或离子交换，但根据你问题的意思，是选定离子交内换。
此时就容要考虑你蛋白的等电点了，如果等电点在你稳定pH之上，就用阳离子交换柱：
设计阳离子交换层析：将你的样品置换到你所指的稳定pH的running buffer。同时装柱，平衡，然后上样，平衡，洗脱（因为你的pH不稳定，建议盐洗脱），收峰。得你的蛋白；
如果你的等电点在稳定pH之下，就用阴离子交换柱，其步骤如上，只是改变柱子类型。

5. 常用蛋白质提取缓冲液有哪些

1.SDS:强烈,可以把疏水性蛋白也充分提取出来,如膜蛋白
2.尿素:有膜蛋白的损失
3.RIPA:用于磷酸化蛋白的温和裂解,不破坏磷酸基团

6. 包被抗体为什么要用偏碱性的缓冲液

需要，第一步即用包被液稀释抗原，4°C包被过夜。包被液为碳酸盐缓冲液：碳酸氢钠 2.93g；碳酸钠1.59g 配成水溶液1L，PH=9.6；4°C保存。

7. 用离子交换法纯化蛋白如何选定缓冲液

也可以用AEC，主要以流穿模式做。sspxiaoji(站内联系TA)用阳离子交换柱，可以考虑pH6.0-7.0的缓冲液，因内为容大部分蛋白质的等电点在这附近，带电荷少，这样容易穿透除去其他杂蛋白。而你的目的蛋白PI在11，挂柱应该比较牢固。但是有个问题需要注意，PH离你的目标蛋白PI太远，有可能导致挂柱后难以洗脱。

8. 如何选择离子交换层析的离子交换剂和缓冲液

这个就要看你要纯化的样品的具体性质来定啦，如果是处于摸索条件的间断，可以尝试最常用的Tris缓冲液。。

9. 单克隆抗体的纯化技术操作步骤

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

10. 什么是缓冲溶液常用的有什么

缓冲溶液（英文：buffer solution）是一种能在加入少量酸或碱和水时大大减低pH变动的溶液。pH缓冲系统对维持生物的正常pH值和正常生理环境起到重要作用。

常用作缓冲溶液的酸类

由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。
硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。
磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想。