超滤怎么验证内毒素

1. 细菌内毒素检查方法是否必须做验证

细菌内毒素的检测必须进行验证方可用于产品验证，因每一个产品的所使用的细菌内毒素限值匀不一样，故须进行验证确定产品的细菌内毒素限值。并确定产品的最终稀释倍数。

2. 热原的检查方法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。
热原除去方法
（一）除去药液中热原的方法
1、活性炭吸附法：即在配液时加入0.1-0.5%（溶液体积）的针用一级活性炭，煮沸并搅拌15分钟，即能除去大部分热原，而且活性炭还有脱色、助滤、除臭作用。但活性炭也会吸附部分药液，故使用时应过量投料，但小剂量药物不宜使用。
2、离子交换法：热原在水溶液中带负电，可被阴树脂所交换，但树脂易饱和，须经常再生。
3、凝胶过滤法：凝胶为一分子筛，利用热原与药物分子量的差异，将两者分开。但当两者分子量相差不大时，不宜使用。
4、超滤法：超滤膜的膜孔仅为3.0-15nm，故可有效去除药液中的细菌与热原。
（二）除去器具上热原的方法
1、酸碱法：因热原能被强酸、强碱或强氧化剂等破坏，所以玻璃容器、用具及输液瓶等均可使用重铬酸钾硫酸清洁液浸泡以破坏热原。
2、高温法：注射用针头、针筒及玻璃器皿等，先洗涤洁净烘干后，再在180℃加热2小时或250℃加热30分钟以上处理破坏热原。
（三）除去溶媒中热原的方法
1、蒸馏法：利用热原的不挥发性来制备注射用水，但热原又具有水溶性，所以蒸馏器要有隔沫装置，挡住雾滴的通过，避免热原进入蒸馏水中。
2、反渗透法：用醋酸纤维素膜和聚酰胺膜制备注射用水可除去热原，与蒸馏法相比，具有节约热能和冷却水的优点。

3. 内毒素去除方法

注射用水内毒素超标的因素有三个：1、注射用水管道受污染：2、注射用水管道不密封：3、出水口污染未清洗干净

4. 细菌内毒素精密过滤器有什么要求

精密过滤是采用成型的滤材，原液通过滤材，滤渣留在滤材壁上，滤液透回过滤材流出，从答而达到过滤的目的。成型的滤材有：滤布、滤网、滤片、烧结滤管、线绕滤芯、熔喷滤芯、微孔滤芯及多功能滤芯。因滤材的不同，过滤孔径也不相同。保安精密过滤是介于砂滤（粗滤）与超滤之间的一种过滤，过滤孔径一般在0.1-120μm范围。同种形式的滤材，按外形尺寸又分为不同的规格。
过滤细菌内毒素对精密过滤器的要求主要在滤芯精度上，常规精密过滤器精度在5μm，细菌内毒素精密过滤器要求精度需要小于5μm，因此需要选择对应精度的滤芯，具体滤芯精度和滤芯材质的选择需要参考水质参数。

5. 成品三批都需要做细菌和内毒素的方法学验证吗

每批次成品复都需要做细菌制和内毒素的方法学验证
细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中应用广泛，通过对无菌氯化钠溶液、配套药盒和成品的细菌内毒素检测，对生产过程进行质量控制。因此对细菌内毒素检验方法的验证就显得尤为重要。
参考文件 中国药典2010年版二部附录XI E

6. 氢氧化钠为什么不用检测细菌内毒素

[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。

[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验
[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2011年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。
1 新药细菌内毒素检查限值的确认
1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式
新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2011版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg?h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg?h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg?h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg?h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。
1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序
首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。
还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。
1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区
1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。
1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。
1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。
1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg?h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。
1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。
2 鲎试剂灵敏度复核试验
2.1 前期准备工作
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。
2.2 灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C?L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20110802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。

7. 超滤 能否去除 热源，内毒素之类的

那就要看产品选择的超滤膜是什么样的型号了。
一般比较好的超滤，会选择膜透过回孔径为5000道尔顿，这样的膜答能绝对去除微生物、热源、内毒素，因为这些杂质最小的也在20000以上。
但是有的产品超滤膜选择20000道尔顿，这样或多或少会有极少量的微生物物质遗漏。

8. 如何建立新药的细菌内毒素检查方法

[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。

[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验
[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2010年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。
1 新药细菌内毒素检查限值的确认
1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式
新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2010版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg・h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg・h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg・h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。
1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序
首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。
还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。
1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区
1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。
1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。
1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。
1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。
1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。
2 鲎试剂灵敏度复核试验
2.1 前期准备工作
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。
2.2 灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C・L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20100802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。

9. 无菌原料药细菌内毒素检查法验证K值确认应如何确认

根据将来原料药制成的制剂的临床用量来计算就可以了。如果已经有比较成熟的制剂，且也是用内毒素检查法检测的，原料药可直接使用制剂的内毒素限值，很多抗生素就是这样的。