① 透射电镜样品为什么要脱水
脱水之后，才能进行石蜡包埋，才能进行切片。
② 扫描电镜中细菌每次脱水用离心吗
细菌样品前处理
取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入
2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2)固定,脱水按常规方法。2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。
(3)临界点干燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。
(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法；
1， 固体培养基中的菌体
用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。 2， 液体培养基中的菌体
取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，加入2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。
0.2M 磷酸缓冲液的配制：
磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O） 2.94克
磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 29克
纯水 500mL
pH调至7.4
2.5%戊二醛固定液的配制：
25% 戊二醛 10mL
双蒸馏水 40mL
0.2mol/L磷酸缓冲液 50mL
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4
③ 心肌老化的治疗
一般认为人的衰老首先源于心血管的老化 ,特别是心肌的老化。近年又有大量证据表明 ,衰老与脂质过氧化关系密切,导致生物膜脂质过氧化物积聚是组织细胞老化的重要原因。这两种认识并不矛盾。因为脂质过氧化突出表现在心血管系统 ,如果心血管生物膜脂质过氧化物积聚 ,心肌和血管老化速度加快 ,衰老过程也就加速。
产生脂质过氧化的因素较为复杂 ,尚未完全明了。但在已经证实的因素中 ,心理应激的负面影响是不容忽视的。所谓心理应激 ,是指各种生活事件 ,诸如家庭不和、丧偶、失去亲人、离异、劳累过度、人际关系紧张、工作出现重大失误等。
如果一个人经常遭遇不同生活事件的刺激而使心理应激状态持续性或间歇重复性存在 ,便可引起体内一系列生理应激反应,并持续存在和发展 ,将使易感器官出现明显的病理改变。
心理应激所造成的生理应激反应表现之一 ,就是刺激机体氧自由基生成增多而发生脂质过氧化损伤 ,进而从结构和功能上促进了心肌的老化。老年人的长期心理应激将在心肌的老化方面起着更加突出和明显的作用。这是因为一来老年人面临的心理应激源多于其他年龄段的人 ,容易形成慢性心理应激状态。二来老年人体内清除氧自由基的能力大大下降 ,其心理应激刺激生成的大量氧自由基无法及时清除 ,特别是心肌抗氧化功能贮备已明显降低 ,更易受脂质过氧化损伤而加速心肌老化。
因此 ,要延缓衰老、养生益寿 ,就应积极减少老年人生活周围的各种心理与生理应激源 ,关注老年人的心理健康与身体健康一样重要。对心脏病的治疗，中医当仁不让
前几年，香港的《中华医药报》来采访我。我谈到一个观点：“现代医学上说，心肌损害是不可逆转的。但我认为，中医可以通过活血化瘀的办法恢复动脉的弹性。”很多心脏病人看到这篇报道高兴得不得了，这就意味着他们不用锯肋骨、开胸，装支架、装起搏器，可以用中药试着来调理。
但很多西医根本不相信，就有人马上打电话给我，他一开始不肯透露身份，只说是来咨询的，他问我：“我看了报纸，说你能把这么多心脏病病人治得这么好，你的草药真有这么好吗？”
在交谈中，我发现他对一些医学术语运用非常娴熟精确，我就问：“你是医生吗？”他最后承认，“是的，我是个主任医生。”
我就说：“人是天生的，中草药是天然的。天生跟天然配在一起，才是原配。搞个人造的东西装在你身上，搞个人造的东西给你吃，肯定不是最好的搭档，人跟自然的中草药，那肯定是最佳搭档。虽然也不能说100个病人吃了我的中药100个病人都能好，因为一样药用在两个人身上，体质不一样效果也不一样的。但有些病，西医做不到的，中医能做到，反过来也一样。所以中西医结合，这才是对人类最大的贡献。”
的确是这样，我并不是一味排斥西医。病人到我这里来，他原来用的许多西药，我会叫他慢慢停，用了中药的代替疗法再停。中西医各有优缺点，为病人着想，凡是适合西医处理的，我都会劝导他接受西医治疗；而适合中医治疗、不适合西医处理时的心脏病，中医同样当仁不让。
中医治的是人
世界上，除了西方医学药学之外，能有自己独立完整的医学药学体系的，恐怕只有中国的中医学和中药学了。中国人对中医还有偏见，中国人不相信自己民族的智慧，这是一件很可悲的事情。很多人拿西医的思路观点来比照中医，得出不科学的结论，这怎么能比呢？中西医是不同层次上的两种科学，不好比的。
我在北京明道草堂坐堂，那里有好几位前辈都是国家领导人的保健医师。著名中医学家樊正伦是明道草堂主任，他说：中医在治病时，常用的方子包括张仲景《伤寒论》的方子、《金匮要略》的方子，学中医的都知道，是两千年以前的方子。为什么两千年以前的方子到现在还有效呢？西医可能会说，你那中药熬完了什么细菌病毒都杀不死。但中医的奥妙就在这儿，它在杯子里谁都杀不死，但喝进去它就可以治好这个病。为什么？因为它用的是药性的偏性来纠正人体的偏性，改善了人体的内环境，让你被破坏的环境得到修复，让致病因子在这儿赖以生存的条件被破坏掉。这样看待中医，我们就看到中医的科学性了。
也正因为如此，所以我们几千年来用的中药现在依然有效。
《黄帝内经》里头，把脏腑比喻成11个当官的，不同的官就有不同的任务，其中心的级别最高，“心主神明”，心是人身上的最高统帅，等于皇帝。“主明则下安”，“主”要是不明呢，连带着脏腑都会出问题。
比如心脏和肝脏，也是有连带关系的。肝脏，是一个藏血、解毒的器官，就像自来水厂，把钱塘江的水引进来，再在净水池里消毒净化。肝脏在不停地把心脏里打出来的血收进来，消毒净化后再送出去。心功能当然会直接影响肝脏功能。
以前我父亲还经常讲：“心肺要同治。”心脏不好，肺也会连带不好。打个比方，隔壁头着火了，连带的那一家也烧焦了，你救火时，当然是两家都要救。你看我现在治心脏病，我就是和肺一起治的。心肺是相护的。肺好了，能够吸收到更多的氧气，提供给心脏。我一般先调心脏，再心肺一起调的。
还有，有些心衰的病人，他吃饭胃口也不好，我就会同时调理心脏和胃肠道功能。胃口不好，也是心衰造成的，这是并发症啊。为啥心功能不好会拉肚子，肠胃也是要心脏来供血的，心脏供血供不到位，肠胃功能肯定要衰退的。
如果是西医的话，你换个科室，你看肠胃科去。中医就不这么想了。
关心心脏，可对照这些细节
心脏不好的人，在他的脸上，五官、皮肤上也会有表现的。人是整体，内外当然息息相关，一棵树根部生了病，叶子也黄了，一样道理。
比如你牙齿灰暗，可能是抽烟抽坏的，也可能是心脏不好。因为牙龈也需要供血，心脏供血不好，牙齿营养就跟不上，就会灰暗。
还有，1997年“海峡两岸学术交流会”上我谈过一个观点：肾跟耳朵的关系。以前好多人把耳鸣当肾虚治疗，百分之九十的医生都这么治疗的。但是，我治耳鸣，年轻的人耳鸣我着重往肾方面治，50多岁的人来，我就全身动脉血管一起调理，果然效果很好。
很多医生是搞理论出身，我是临床出身，要讲理论我讲不过他们，但实践出真知。在学术交流会上我跟那些心血管医生聊过以后，他们恍然大悟：怪不得老年性耳鸣，他们用治肾的办法怎么都不行。
再说我一个朋友，年轻时脸上一点斑都没有，突然之间脸上有一块一块的黑斑，到美容院里去弄，弄不掉。后来心脏不好了，就到我这里吃中药，吃了3个月，斑退下去了。她脸上的这个斑，就是心脏不好的表征。因为脸上的颜色取决于血液中氧的含量的多少，氧含量高脸色显得红润，反之则暗。当心功能差时，心肌的弹性也差了，打出去的血不能及时回收，缺氧的血滞留在脸上，日积月累脸上就越来越暗。四肢血液的回流也差，就会引起脚麻、手麻，发冷。
说到这里我强调一下，如果你年轻的时候就有雀斑，跟遗传有关系，不要紧，你去美容院好了。但如果你35岁、40岁以后突然四肢发冷，脸上斑点多了，那就跟心脏及其他脏腑器官有关系，就要到医生那里去看一下。
45岁之后，人的心脏就走下坡路了。我们的心脏每一分每一秒都在跳动，眼睛有闭上的辰光，心脏却不能停的。心脏是我们人体中最疲劳、最辛苦、对我们人类贡献最大的一个脏器，所以我们大家都要关心它啊。
中医治心脏病，绝对不是慢郎中
一般人的意识中，都承认中医治病很好，就是效果太慢，治慢性病还行，治急性病就不如西医——这绝对是对中医的误解。
中医急诊，其实是中医的重要内涵，也是中医疗效的体现。比如治疗心肌梗塞，过去西医有一套疗法，但成功率不高。1956年提倡中西医结合后，心肌梗塞的死亡率才明显下降。
我再给大家讲个例子。去年5月份，浙江某省级医院有一位老院长患心肌梗塞，我去会诊。他是这样的情况：冠心病多年，心肌梗塞两次，卧床多年引起肺功能下降，接着引起肺炎和肺积水，胸腔积液，去年5月份是第3次严重的心肌梗塞发作。当时医生都说救不过来了，最后抽积水抽到不敢再抽了。胸腔积液不好老是抽的，因为胸水，所谓胸水，指的是存在于胸肌和内脏隔层中的液体，少量的胸水是正常现象，主要起润滑作用，只有当胸水超过了一定的量，才属病症，才被称为胸水。但无论是“正常”的胸水，还是病症的“胸水”，其中所含成分几乎一样——富含人体所必须的多种重要营养。病人本身已经很虚弱了，再这样白白地抽取营养，等于是雪上加霜。
他后来是没法抽了，就是氧气吸在那里，24小时不敢断，平躺在那里话都不会讲的。这样的病人，中医有办法吗？
中医有啊，我就用一根长长的吸管，吹药粉进去。吹的是什么？麝香。用吸管往他嘴巴里面吹，然后再点了几个穴位，他眼睛就慢慢睁开了，想跟我说话。我们叫他不要说，他嘴巴想动，想说话，眼睛里是很渴望生存、很感激的眼神。他女儿女婿都看得出来，他女儿哭着说：“我爸爸很感激你，他想求你救命，你来了等于抓到一根救命稻草，我是他女儿，我看得出来。”
那天等我走的时候，他的情况是基本上稳定了，我叫他女儿再跟着我去配三帖药，我说，这3帖药下去，有用就有用，没用我就不看了，我也没办法了。结果3天以后，他女儿打电话来告诉我：“爸爸早上起来想吃稀饭，中午的时候还把一条鱼都吃光了。”
老院长会说话以后，我去看他，他不准我自己开车去，一定要让他女婿开车来接我。他说：“我这条命是你拣回来的。”他女儿后来说，爸爸是个离休的军队老干部，脾气很固执的，我们家里人讲什么他都不听的，他现在就听你的话，你说叫他干什么他就干什么，他当圣旨一样。
可能大家都奇怪，简简单单一味麝香，为啥效果会这么好？
“神农尝百草”的故事告诉我们，哪味中药好用，哪味中药不好用，都不是凭空想想出来的，而是我们的老祖宗在几千年的临床摸索中总结出来的。说到麝香，我国古代名医华佗曾用麝香、丁香等制成小巧玲珑的香囊，悬挂于室内，用来治疗肺结核、吐泻等疾病。麝香的主要功效是芳香开窍。心肌梗塞，是心肌老化以后引起心肌的收缩功能差，心肌供氧供血供不上。麝香有兴奋呼吸、加速脉搏、升高血压和强心的作用。你看，这味中药用在心肌梗塞上，不是正对路吗？
当然，这仅仅是急诊的办法，临时应应急的。平时我很少用这个药，等病人的心绞痛、心肌梗塞的症状改善了，也不用这个药了。以前没有吸管，我父亲都是用麦秆吹的，吹好以后，多出来的一点药粉包起来，放在左胸的贴身口袋里面。女的就放在左胸乳房边，最好是贴肉放。像老院长这样，半个月以后就能自己下地走路了，不过病情还没完全稳定。等最后稳定下来，胸闷啊、气急啊这种症状就全部消失了。
④ 试以某一生物样本做透射电镜观察,采用超薄切片法制备样本,详细论述处理过程
摘要 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
⑤ 请教：植物叶片作扫描电镜分析前需作哪些处理急！
这要看你使用的电镜是什么样的
一般不用再做什么处理，直接做切片进行观察就可以了，应该有专门的做电镜的老师会告诉你的吧
⑥ 要对细菌做SEM，前处理是什么需要把细菌弄成干态或者固定是吗求详细的步骤
取样，戊二醛等固定液固定，酒精梯度脱水，冷冻干燥or二氧化碳临界点干燥，喷金或蒸碳。
以上四个步骤，根据所使用的SEM成像的真空模式，可以有所省略。
如果用ESEM，取样后可直接放入样品室，在一定“环境真空”下进行观察；如果采用LV模式，直到干燥，可以免喷金；高真空模式，必须做到喷金等样品导电处理。
具体可到公益网站：中山大学生物电子显微学实验室网站查询
扫描电镜样品制备: 基础课程，生物样品因含水，其样品制备有其特殊性。
http://bioem.sysu.e.cn/wiki/index.php/%E9%A6%96%E9%A1%B5
有时候公益网站有点那个，不好点开，请看转载链接http://coxem2010.blog.163.com/blog/static/16510375720114192413945/
⑦ 请问生物膜做扫描电镜该怎么做固定处理
扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了。1942年，英国首先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值不大。经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到
1956年开始生产商品扫描电镜。近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。
一．扫描电镜的特点
和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：
(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。
(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。
(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。
(四) 景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。
(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。
(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。
(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。
二．扫描电镜的结构和工作原理
(一) 结构
1．镜筒
镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm)，并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号。
2．电子信号的收集与处理系统
在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。在上述信号中，最主要的是二次电子，它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至
几十nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分。通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送到显像管的栅极。
3．电子信号的显示与记录系统
扫描电镜的图象显示在阴极射线管(显像管)上，并由照相机拍照记录。显像管有两个，一个用来观察，分辨率较低，是长余辉的管子；另一个用来照相记录，分辨率较高，是短余辉的管子。
4．真空系统及电源系统
扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成，其作用是使镜筒内达到 10(4～10(5托的真空度。电源系统供给各部件所需的特定的电源。
(二) 工作原理
从电子枪阴极发出的直径20(m～30(m的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针。在物镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。这些电子信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征。第二节 扫描电镜生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分，而且比较柔软，因此，在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没
有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。
一．样品的初步处理
(一) 取材
取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，可参考第十四章超薄切片技术中所提的要求。但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组
织表面。
(二) 样品的清洗
用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察。因此，在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。清洗的方法有以下几种：
1．用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；
2．用5%的苏打水清洗；
3．用超声震荡或酶消化的方法进行处理。例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法：
清洗液配方：透明质酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5～6。清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水洗3次。无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品。
(三) 固定
固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。
(四) 脱水
样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。
二．样品的干燥
扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种：
(一) 空气干燥法
空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用
于表面较为坚硬的样品。
(二) 临界点干燥法
临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3小
时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。但用此法，需要特殊仪器设备。
临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：
1．固定、脱水：按常规方法进行。如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮置换15～20分钟。
2．转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15～30分钟。
3．移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品室内，盖上盖并拧紧以防漏气。
4．用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31(C , 72.8大气压)后，将温度再升高10(C，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。
(三) 冷冻干燥法
冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样
品的损伤。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥。
1．含水样品直接冷冻干燥法
1.1 取材固定：按常规方法进行。
1.2 置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。
1.3 骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(C的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。
1.4 干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。
本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。
2．样品脱水后冷冻干燥
样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。和前一种方法比较，本方法的优点是不会产生冰晶损伤，
且干燥时间短。不足之处是有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥的方法。其操作步骤如下：
(1). 固定、水洗：按常规方法进行。
(2). 乙腈置换：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置换，最后用100%乙腈代替，每步骤15～20分钟。
(3). 干燥：至纯乙腈时，放入真空镀膜台抽真空，乙腈和样品在真空中很快致冷而被冻结(冻结的温度为(45(C)，变成冰状固体。然后继续抽真空，使冻结的乙腈升华，约需30分钟，样品即达干燥。
样品干燥后要粘在样品台上。对于不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固；对于要镀膜的样品，则可以用胶水或万能胶来代替，微细的样品如粉末、纤维等也可用双面胶纸来粘贴。
三．样品的导电处理
生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种：
(一) 金属镀膜法
金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。
1．真空镀膜法
真空镀膜法是利用真空 膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热，当加热到熔点以上时，会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，在样品表面形成一层金属膜，使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒，有用铂或用金—钯、铂—钯合金的。金属膜的厚度一般为10nm～20nm。真空镀膜法所形成的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，目前已经较少使用。
2．离子溅射镀膜法
在低真空(0.1～0.01乇)状态下，在阳极与阴极两个电极之间加上几百至上千伏的直流电压时，电极之间会产生辉光放电。在放电的过程中，气体分子被电离成带正电的阳离子和带负电的电子，并在电场的作用下，阳离子被加速跑向阴极，而电子被加速跑向阳极
。如果阴极用金属作为电极(常称靶极)，那么在阳离子冲击其表面时，就会将其表面的金属粒子打出，这种现象称为溅射。此时被溅射的金属粒子是中性，即不受电场的作用，而靠重力作用下落。如果将样品置于下面，被溅射的金属粒子就会落到样品表面，形
成一层金属膜，用这种方法给样品表面镀膜，称为离子溅射镀膜法，图15(3显示该法的原理。
图15(3 离子溅射镀膜法原理图
和真空镀膜法比较，离子溅射镀膜法具有以下优点：(1)由于从阴极上飞溅出来的金属粒子的方向是不一致的，因而金属粒子能够进入到样品表面的缝隙和凹陷处，使样品表面均匀地镀上一层金属膜，对于表面凹凸不平的样品，也能形成很好的金属膜，且颗粒较
细。(2)受辐射热影响较小，对样品的损伤小。(3)消耗金属少。(4)所需真空度低，节省时间。
(二) 组织导电法
用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属 溶液对生物样品中的蛋白质?脂类和醣类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。
此法的基本处理过程是将经过固定、清洗的样品，用特殊的试剂处理后即可观察。由于不经过金属镀膜，所以不仅能节省时间，而且可以提高分辨率，还具有坚韧组织，加强固定效果的作用。
组织导电法主要有碘化钾导电染色法、碘化钾--醋酸铅导电法、丹宁酸—锇酸导电法等。比较常用的是丹宁酸—锇酸导电法，其具体操作方法如下：
(1)．样品处理：按常规方法取材、清洗及用戊二醛固定。
(2)．导电染色：将样品放入2%～4%丹宁酸溶液中浸泡。如果观察表面结构，浸泡时间为30分钟；如果观察内部结构，浸泡时间为8小时，即可过夜。在浸泡过程中，可更换一次溶液。
(3)．清洗及再固定：用磷酸缓冲液充分清洗，然后放入1%锇酸中固定2～4小时，再用磷酸缓冲液清洗。
(4)．脱水和干燥：按常规方法。
(5)．扫描电镜观察。
四．几种特殊的样品制备技术
(一) 细胞内部结构冷冻割断法
1972年，日本学者田中敬一采用冷冻树脂割断法将细胞打开，用扫描电镜观察细胞的内部结构。后来他又以二甲基亚砜代替树脂进行冷冻割断取得成功，该方法简便，结构清晰，已得到广泛应用。其操作方法如下：
1．取材和固定：为了使细胞结构清晰，不被过多的血细胞污染，可在取材前用灌注法冲洗。即先将动物麻醉，经腹主动脉注入生理盐水或低分子量的右,切开下腔静脉放血，至无血色为止。然后迅速取材，将样品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%锇酸溶液中固定1小时，用1/15M磷酸缓冲液 (pH7.4)清洗两次，每次10分钟。
2．二甲基亚 浸泡：将样品依次放入25%、50%二甲基亚砜溶液中，各浸泡30分钟。
3．割断：用TF—1型冷冻割断装置进行割断。然后将割断后的样品放到50%二甲基亚砜中，等融化后再用1/15M磷酸缓冲液浸洗，每次10分钟，换液5次。
4．软化及后固定：将样品放入0.1%锇酸中软化，温度20(C，时间48～72小时。然后用1% 八 固定1小时，双蒸水浸洗1小时，换液几次，需彻底清洗干净。
5．导电染色：将样品放入2%丹宁酸中2小时(或过夜)，以双蒸水清洗1小时，换液几次。再以1% 八 固定30～60分钟，双蒸水清洗1小时。
6．脱水、干燥及镀膜：按常规方法进行。
(二) 铸型技术
为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。如果是研究血管系统，称为血管铸型。用铸型技术制作的标本，经过镀膜后，就可进行扫描电镜观察。
常用的铸型剂有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被认为是比较理想的铸型剂。下面简单介绍用ABS制作血管铸型标本的方法：
1．灌流和注入铸型剂
首先将准备灌注的器官取下或保持自然位置，找到动脉，插入玻璃管或静脉穿刺针，并以粗丝线结扎之，用普通流水或温盐水将血管中的血液冲洗干净。然后灌注铸型剂ABS丁酮溶液，浓度为5%～30%，注入的压力为100mmHg。注入铸型剂的脏器，可以放在50(C～60(C 的温水中浸泡6小时左右，这样既能保持脏器的原形，也有助于铸型剂的硬化。
2．腐蚀和清洗
将标本放入10%～20%氢氧化钠或氢氧化钾溶液中腐蚀，也有放20%～30%盐酸中腐蚀。时间一般为5～7天。若用稀盐酸腐蚀，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蚀的效果更好。然后用流水将血管铸型周围被腐蚀的组织冲洗干净，时间为24～72小时，冲洗的速度要慢。
3．显微解剖和剥制铸型
为了暴露和切取要观察的部分，需要在解剖显微镜下进行。如果铸型太硬，可将铸型浸入酒精中，加温至40～60(C，能使铸型变软，便于解剖和切取。
4．干燥和镀膜
将切取的铸型用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干后放37(C温箱中30～60分钟，最后放干燥缸中保存。镀膜可用真空喷镀，也可用离子镀膜，方法同前。镀膜后就可用扫描电镜观察
。
(三) 盐酸化学消化法
为了研究被观察细胞的基底面及深层细胞表面，可采用盐酸化学消化法制备样品。
1．固定和清洗：同常规方法。
2．盐酸消化：用8mol/L盐酸消化和腐蚀，其温度与时间根据不同组织而异。
3．清洁样品：用2%～5%Tween20作用3小时，以清洁样品和稳定其结构。
4．脱水、干燥和镀膜：按常规方法处理。
⑧ .下列哪种标本的制备过程包括固定-脱水-包埋-切片-染色 (分值：1分) A.透射电子显微镜 B.扫描电子显微
A.典型的电镜实验需要对实验样品经过以上四步操作。而扫描电镜原理与透射电镜不同，无需处理样子，可直接观察。
⑨ 细菌做生物扫描电镜前怎么洗涤
1样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
2倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
3用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；
4倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
5用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。
⑩ 生物组织扫描电镜实验的前期处理有哪些步骤
生物组织扫描电镜实验的前期处理有哪些步骤
1．实验方法 实验方法是整个实验设计的精髓,是做好实验设计的关键所在.现将与中学实验有关的一些最常见的经典的实验方法汇总如下： (1)化学物质的检测方法： ①淀粉——碘液 ②还原糖——斐林试剂、班氏试剂 ③CO2——Ca(OH)2溶液或酸碱指示剂 ④乳酸——pH。
采用低速离心（细胞离下来的转数即可，如1000rpm-1500rpm），然后将沉淀转入2.5-4%的戊二醛中固定（2h以上，可于4度放至几天），然后再次离心，用丙酮逐级脱水（30%，50%，70%，80%，90%，100%，100%）再用叔丁醇置换，然后真空冷冻干燥，接下来将细胞粉（抽干应呈现为粉末状）涂抹在导电胶上，再将导电胶粘放到样品台上进行喷金处理，处理好的样品就可以放入扫描电镜样品室进行观察拍照了。