凝胶半透膜

『壹』 证明蛋白质不能透过半透膜的小实验

1.根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离.超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程.这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开.它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法.当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的...

『贰』 半透膜包埋法的原理是什么

半透膜包埋法的原理利用高分子聚合物形成的半透膜将细胞包埋，形成微弱型固定化细胞。包埋法的原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。

『叁』 蛋白质的分离方法有哪些它们各依据蛋白质的什么性质或特点

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH
范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex
ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity
chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

『肆』 酶的固定化方法有哪些

一、包埋法
定义：将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法。
分类：根据载体的材料和方法的不同分为凝胶包埋法（网格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）。
1、凝胶包埋法：应用最广泛的固定化方法。
定义：以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法。
载体：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
注意事项：凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内；不适于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。
2、半透膜包埋法
定义：将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。
载体：聚酰胺膜、火棉胶膜等。 适用：底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。
方法：将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊中。

二、结合法
定义：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。
分类：根据酶与载体结合的化学键不同分为离子键结合法、共价键结合法。
1、离子键结合法
定义：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。
载体：某些不溶于水的离子交换剂，如DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶。
方法：一定条件下，酶与载体混合搅拌几小时，或是将酶液缓缓流过处理好的离子交换柱。
特点：结合力较弱，在pH、离子强度等条件改变时，酶容易脱落。
使用注意：pH、离子强度、温度等的控制。
2、共价键结合法
定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。
常用载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等
可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
特点：结合牢固、酶不会脱落、可连续使用较长时间；载体活化的操作复杂；共价结合可能影响酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。

『伍』 酶、细胞、原生质体固定化

酶的一些不足之处：
（1）酶的稳定性较差
（2）酶的一次性使用
（3）产物的分离纯化较困难
◆改善方法之一就是固定化技术的应用:
(1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶.固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有增加稳定性,可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点.
(2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞.也称为固定化活细胞或固定化增值细胞.通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产.
(3) 固定化原生质体技术,有利于胞内物质的分泌.
1. 酶固定化
◆采用各种方法,将酶与水不溶性的载体结合,制备固定化酶的过程称为酶的固定化.固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶.
◆固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体,它是固定化酶的一种形式.
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等.
(1)吸附法：
◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上,而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法.
◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等.
◆靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用受到一定的限制.
(2)包埋法
◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法.
◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等.
◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时,根据载体材料和方法的不同,可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类.
◇凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体.大多数为球状或片状,也可按需要制成其他形状.
常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶.
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内,制成固定化酶.
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等.
(3)结合法
◆选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法.
◆根据酶与载体结合的化学键不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法.
◇离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法.
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂.常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等.
◇共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法.
共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等.
酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等.
◇要使载体与酶形成共价键,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进一活泼基团.然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键.
◇使载体活化的方法很多.主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等.
(4)交联法
◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法.交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化.
◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等.其中应用最广泛的是戊二醛.
(5)热处理法
◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体内,而制备得到固定化菌体.◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化,在加热处理时,要严格控制好加热温度和时间,以免引起酶的变性失活.
1.2固定化酶的特性
(1)稳定性:固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好.
(2)最适温度: 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多,活化能也变化不大.
(3)最适pH值: 酶经过固定化后,其作用的最适pH值往往会发生一些变化.
◆影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个,一个是载体的带电性质,另一个是酶催化反应产物的性质.
(4)底物特异性: 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同,其变化与底物分子量的大小有一定关系.对于那些作用于低分子底物的酶,固定化前后的底物特异性没有明显变化.
◆固定化酶底物特异性的改变,是由于载体的空间位阻作用引起的.
1.3固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有如下显著的优点：
（1）酶的稳定性增加,减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响,可以较长期地保持较高的酶活力.
（2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间,提高酶的利用价值,降低生产成本.
（3）固定化酶易于和反应产物分开,有利于产物的分离纯化,从而提高产品质量.
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域.

2.细胞固定化
◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合,制备固定化细胞的过程称为细胞固定化.(固定化活细胞或固定化增殖细胞)
◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞.
2.1细胞固定化的方法
◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法.
(1)吸附法
◆利用各种固体吸附剂,将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法.
◆用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等.
(2) 包埋法
◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法.
◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法.
◇以各种多孔凝胶为载体,将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法.
○凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法,适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化.
○凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等.
2.2微生物细胞固定化
2.2.1固定化微生物细胞的特点：
①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态,稳定性好.
②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系,可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢,并进行有效的代谢调节控制.
③发酵稳定性好,可以反复使用或者连续使用较长的一段时间.
④固定化微生物细胞密度提高,可以提高产率.
⑤提高工程菌的质粒稳定性,
2.2.2固定化微生物细胞的应用
◆主要用在两个方面：
◇是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物.
◇二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极.
(1)利用固定化微生物生产各种产物
(2)固定化微生物细胞制造微生物传感器
2.3植物细胞固定化
2.3.1固定化植物细胞的特点：
（1）植物细胞经固定化后,由于有载体的保护作用,可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响,提高植物细胞的存活率和稳定性.
（2）细胞经固定化后,被束缚在一定的空间范围内进行生命活动,不容易聚集成团.
（3）固定化植物细胞发酵可以简便地在不同地培养阶段更换不同的培养液,即首先在生长培养基中生长增殖,在达到一定的细胞密度后,改换成发酵培养基,以利于生产各种所需的次级代谢物.
（4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间,大大缩短生产周期,提高产率.
（5）固定化植物细胞易于与培养液分离,利于产品的分离纯化,提高产品质量.
2.3.2 植物细胞固定化的方法：
◆植物细胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法两种.
◆吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上.
◆包埋法是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中.包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同.
2.3.3固定化植物细胞的应用：
◆固定化植物细胞的主要用途是制造人工种子,就有可能获得大量具有相同遗传特性的植株.对种质的保存具有重要意义.并可以节约种子的用量.
◆固定化植物细胞还可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物.
2.4动物细胞固定化
2.4.2固定化动物细胞的特点：
（1）提高细胞存活率：动物细胞经固定化后,由于有载体的保护作用,可以减轻或免受剪切力的影响,同时动物细胞可附着在载体表面生长,从而可显著提高动物细胞的存活率.
（2）提高产率：动物细胞固定化后,可先在生长培养基中生长繁殖,使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度.然后可简便地改换成发酵培养基,控制发酵条件,使细胞从生长期转变到生产期,以利于提高产率.
（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间.例如,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天.
（4）固定化细胞易于与产物分开,利于产物分离纯化,提高产品质量.
2.4.2动物细胞固定化方法：
◆动物细胞固定化地方法有吸附法和包埋法两种.
(1)吸附法：
◆大多数动物细胞属于附着细胞,它们在培养过程中,必须趋向于附着在固体表面.故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化.
◆转瓶是由玻璃或塑料制成,表面经过一定方法处理而带上电荷.
◆微载体是指颗粒细小的固定化载体,直径一般为100～200μm,相对密度接近1.0.是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成.微载体已用于多种动物细胞的固定化；
◆中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成.
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般适用于悬浮细胞.
◆根据载体和方法的不同,有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种.
①凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化.细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢,由于有载体的保护,动物细胞有较好的稳定性,可显著提高其存活率.
用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等.
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋,形成微囊型固定化动物细胞.
2.4.3固定化动物细胞的应用：
动物细胞中大部分为贴壁细胞,需要贴附在载体的表面才能正常生长.所以固定化动物细胞广泛应用.特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化.

3.原生质体固定化
◆固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段.
3.1原生质体的制备
◆不同种类的细胞,由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同,原生质体的制备方法也不一样.
◆原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来,悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中.然后加入适宜的细胞壁水解酶,在一定的条件下作用一段时间,使细胞壁破坏.分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶,而得到原生质体.
◆除去细胞壁所使用的酶应根据细胞壁的主要成分的不同而进行选择.
◇细菌的细胞壁主要成分是肽多糖,所以细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母细胞壁主要由β-葡聚糖构成,故采用β-1,3-葡聚糖酶；
◇霉菌的细胞壁组分比较复杂,除含有几丁质外,还有其他多种组分,故要去除霉菌的细胞壁,则需有几丁质酶与其他有关酶共同作用.
◇植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶组成,故制备植物原生质体时主要应用纤维素酶和果胶酶.
◆为防止制备得到的原生质体破裂,应加入适当的渗透压稳定剂.如：无机盐、糖类、糖醇等化合物.
◆应选择对数生长期的细胞制备原生质体,以获得较高的原生质体形成率.
◆所加进的细胞壁溶解酶的种类和浓度、酶作用温度,pH值以及作用时间等对原生质体的制备都有明显影响,必须经过试验确定其最佳条件.
3.2原生质体固定化
◆采用包埋法制成固定化原生质体.
◆原生质体固定化一般采用凝胶包埋法.常用的凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等.
3.3固定化原生质体的特点：
(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障,可增加细胞膜的通透性,有利于氧气和营养物质的传递和吸收,也有利于胞内物质的分泌,可显著提高产率.
(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用,具有较好的操作稳定性和保存稳定性,可反复使用和连续使用较长的时间,利于连续化生产.在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力.
(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开,有利于产物的分离纯化,提高产品质量.
(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂,以保持原生质体的稳定性.这些渗透压稳定剂在发酵结束后,可用层析或膜分离技术等方法与产物分离.
3.4固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性,可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物,另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障,有利于胞内产物不断地分泌到胞外,这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物,为胞内物质的工业化生产开辟了新途径.
固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等.

『陆』 疏水性凝胶为什么只能在有机溶剂中操作

当这种凝胶浸入水或水溶液后，由于相分离作用在凝胶表面快速形成了半透膜的结构，导致有机凝胶与水发生强烈的不对称扩散行为。由于有机溶剂被有效保留在凝胶中，产生较高的渗透压从而驱使水渗透进凝胶当中。而吸收水后有机凝胶由于相分离会在内部形成多孔结构。龚剑萍等人以PMA为疏水性聚合物，THF与DMSO作为亲水性有机溶剂对该反常现象进行研究，并以其他疏水性聚合物/亲水性有机溶剂体系附以验证，相关成果以题目为“Hydrophobic Hydrogels with Fruit-Like Structure and Functions”的研究论文发表在《Advanced Materials》上。

【图文解析】

图1有机凝胶经历溶剂交换的体积变化以及“hydrophobic hydrogels”的形成过程

当有机凝胶浸入到水中，相分离过程随即发生。由于不同有机溶剂与聚合物和水的相对亲和力不同，有机凝胶在水中发生正常的收缩（图(a)）与异常的膨胀行为（图(b)），(a)和(b)的点线图为有机凝胶原始大小。图(c)为正常的收缩现象，经THF溶胀后的PMA（左）与浸入水8h的PMA-THF有机凝胶（右）。图(d)为异常的膨胀现象，经DMSO溶胀后的PMA（左）与浸入水8h的PMA-DMSO有机凝胶（右）。图(e)为两种有机凝胶与水作用后的膨胀率随时间的变化，起始状态为直径35mm、厚度2mm的碟状凝胶。图(f)为PMA/DMSO被水溶胀前后的单向拉伸图，曲线上的字为杨氏模量。图(g)为PMA/DMSO有机凝胶被水溶胀后其DMSO的残留量随时间的变化。图(h)为被盐溶液溶胀后的PMA/DMSO有机凝胶其内部盐离子的浓度，Rh为阳离子的水合半径，小图为NaCl溶液随时间变化的溶胀行为

『柒』 在化学中，过滤器放的一定是滤纸吗如果放半透膜，还叫过滤器么

“超过滤器”
半透膜过滤法 即用孔径较大的半透膜，在压差（一般在0.7～10千克力／厘米专2）和紊流流动属的情况下，溶液中的溶剂和电解质等能透过半渗透膜，而胶体、微粒和分子量较大的物质则被截留。这种方法的分离能力比微滤法高，因而称为超过滤。溶液中的大分子物质分散系的渗透压很小,所以超过滤法所需的操作压力较低。超过滤法的透水速度开始时随着操作压力提高而增加，但当大分子物质在膜表面积累形成凝胶层后，透水速度就与操作压力的变化无关，而同凝胶层的阻力大小成反比。 目前应用较广的半透膜是醋酸纤维素膜，其次为芳香聚酰胺膜，中国普遍应用前者。醋酸纤维素膜是一种不对称膜，由表面致密层和支撑层组成。表面致密层起脱盐作用,厚约0.2～1.0微米,占膜总厚度的0.2～1.0％；支撑层是多孔结构，起支撑表层的作用并便于透水。芳香聚酰胺膜也是一种不对称膜。成膜材料主要为芳香聚酰胺、芳香聚酰胺- 酰肼以及其他一些含氮芳香聚合物。此外还有聚苯砜对苯二甲酰胺膜、聚苯并咪唑膜、磺化聚苯醚膜、磺化聚砜膜、聚四氟乙烯接枝膜、无机的多孔玻璃膜和氧化石墨膜等等。

『捌』 半透膜能过滤碱水吗

可以的。
半透膜过滤法 即用孔径较大的半透膜，在压差（一般在0.7～10千克力/厘米2）和紊流流动的情况下，溶液中的溶剂和电解质等能透过半渗透膜，而胶体、微粒和分子量较大的物质则被截留。这种方法半透膜过滤法 即用孔径较大的半透膜，在压差（一般在0.7～10千克力/厘米2）和紊流流动的情况下，溶液中的溶剂和电解质等能透过半渗透膜，而胶体、微粒和分子量较大的物质则被截留。这种方法的分离能力比微滤法高，因而称为超过滤。溶液中的大分子物质分散系的渗透压很小,所以超过滤法所需的操作压力较低。超过滤法的透水速度开始时随着操作压力提高而增加，但当大分子物质在膜表面积累形成凝胶层后，透水速度就与操作压力的变化无关，而同凝胶层的阻力大小成反比。 目前应用较广的半透膜是醋酸纤维素膜，其次为芳香聚酰胺膜，中国普遍应用前者。醋酸纤维素膜是一种不对称膜，由表面致密层和支撑层组成。表面致密层起脱盐作用,厚约0.2～1.0微米,占膜总厚度的0.2～1.0%；支撑层是多孔结构，起支撑表层的作用并便于透水。芳香聚酰胺膜也是一种不对称膜。成膜材料主要为芳香聚酰胺、芳香聚酰胺- 酰肼以及其他一些含氮芳香聚合物。此外还有聚苯砜对苯二甲酰胺膜、聚苯并咪唑膜、磺化聚苯醚膜、磺化聚砜膜、聚四氟乙烯接枝膜、无机的多孔玻璃膜和氧化石墨膜等等。的分离能力比微滤法高，因而称为超过滤。溶液中的大分子物质分散系的渗透压很小,所以超过滤法所需的操作压力较低。超过滤法的透水速度开始时随着操作压力提高而增加，但当大分子物质在膜表面积累形成凝胶层后，透水速度就与操作压力的变化无关，而同凝胶层的阻力大小成反比。 目前应用较广的半透膜是醋酸纤维素膜，其次为芳香聚酰胺膜，中国普遍应用前者。醋酸纤维素膜是一种不对称膜，由表面致密层和支撑层组成。表面致密层起脱盐作用,厚约0.2～1.0微米,占膜总厚度的0.2～1.0%；支撑层是多孔结构，起支撑表层的作用并便于透水。芳香聚酰胺膜也是一种不对称膜。成膜材料主要为芳香聚酰胺、芳香聚酰胺- 酰肼以及其他一些含氮芳香聚合物。此外还有聚苯砜对苯二甲酰胺膜、聚苯并咪唑膜、磺化聚苯醚膜、磺化聚砜膜、聚四氟乙烯接枝膜、无机的多孔玻璃膜和氧化石墨膜等等。

『玖』 聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验材料

一．设备
进行凝胶电泳的装置见图版4。
1）直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器（硅或硒整流器），调压范围0—300伏。
2）电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳 管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部钻孔。插入电泳管，用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长10厘米，内径 ^5毫米。脱色用玻璃管长10厘米，内径8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。
3）凝胶管架灌装凝胶管时使管保持垂直位置，用有机玻璃制成。
二．操作方法
1）凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝胶溶液（方法见下文）。每管加至液体高度为7．5厘米。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地加一层（高约1厘米）蒸馏水于表面上，勿使与凝胶液混合，室温放置。如果条件合适溶液于 30—60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重结晶）25克，双体（甲醇重结晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要时用三羟甲基氨基甲烷调pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羟甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析纯0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚剂以延缓凝聚时间。使操作方便，如凝聚时间已足够长可以用蒸馏水代替。溶液丁：过硫酸铵（二级）2．8克加水至 100毫升新配。必要时用氨水调pH至7．0 c， 溶液甲及乙配后可在冰箱中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。
2）准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中，在上下两槽内分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中，管下端勿留气泡。血清电泳可以用巴比妥缓冲液pH一8．6，离子强度0．05（配法：巴比妥钠10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，温热使溶。加硫柳汞0．1克防霉）。
3）加样在资料介绍的方法中，一般还在了这一步。在血清样品中加入少量蔗糖以增加密度，用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上，加样量一般为7微升血清。如果在样品中混入少量溴酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。
4）电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1一2小时。电泳完毕取下凝胶管，用细长针头沿管壁注蒸馏水，使凝胶与管壁剥开。然后用橡皮球压出凝胶条。
5）染色及脱色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中（图2）。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脱色时电场强度25伏/厘米，电流10—1 5毫安/管。3—4小时脱色完毕。增高电压可以加速脱色。有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。
6）保存与记录脱色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然干燥后保存，在需要观察时再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。
三、实验结果
1．电泳条件的选择
为了选择血清蛋白电泳较合适的条件，我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙腈的浓度、过硫酸铵的浓度等条件进行了试验。根据以上试验结果，我们在分离血清蛋白时选用的条件是：单体浓度6.25-6.5%，双体占总丙烯酰胺量的4—5%，正离子采用三羟甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及过硫酸铵浓度分别为0.25%及0.7%。电泳电压以7—10伏/厘米较为合适。但电泳时间较长，约2—3小时，室温低时可以电压稍高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。
2．人血清及其酒精分划部分的凝胶电泳
采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15—20条区带。我们也根据RaFmand介绍的两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电泳上的a：区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d，区带的一部分则与凝胶电泳中自蛋白区带相重合。二种电泳方法所得的图谱见图版9。在正常人血清中后白蛋白（PA）、转铁蛋白(Tr）和触珠蛋白（HP）均有不同的型， 一例骨髓瘤病人血清的和凝胶电泳自由电泳图谱的比较见图版11、12。我们也比较了酒精分划人血浆各部分的纸电泳和凝胶电泳图谱，结果见图版13。从图中可见在纸上电泳检定时看来较纯晦白蛋白和丙种球蛋白部分，在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。
3．放射病狗血清蛋白电泳的观察 放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资 料。正常狗血清的凝胶电泳图谱大致与人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 显变化，至极期时则可以观察到鸭、Tr、融及 sp等区带有明显增高。我们用胎3—10型光 谱仪用光密度计将电泳图谱进行了扫描，所得 结果见图3，图版14。由于仪器的限制光缝 最小只能达到0．5毫米，从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况，这 远比纸电泳中所见更为明显。我们认为如果联 系临床表现对变化的本质进行一些研究，将有 助于了解放射病极期来到前后体内蛋白质代谢的一些情况。
4．在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳 观察 用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上的蛋白质区带（见图版14）。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上，在37c’温箱中保温2—3小时，再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上，可以看到乳白色本底上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化的情况。
四、结 论
本文介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的一些初步实验条件和实验结果，并与纸电泳、自由电泳等进行了对比。从结果中可以看到聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强，重演性良好。它在临床生化分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有较广泛应用的可能性。

『拾』 生物教材中还提到哪些不能透过半透膜的小分子

半透膜（semipermeable membrane），是抄一种对不同质点的通过具有选择性的薄膜。一种由线状胶体粒子交织而成的立体网状结构的凝胶薄膜。依靠膜的筛滤作用或选择溶质作用,能使某些物质(如水)透过,而另一些物质(如蛋白质)不能透过。例如动、植物的细胞壁,动物的膀胱膜,羊皮纸以及人工合成的一些无机、有机多孔性半透膜如硝酸纤维、醋酸纤维等。

物质能否通过半透膜，一是取决于膜两侧的浓度差，即只能从高浓度的一侧向低浓度的一侧移动；二是取决于该物质颗粒直径的大小，即某物质颗粒直径只有小于半透膜的孔径才能自由通过，否则不能。物质通过半透膜遵循扩散作用的原理，是自由扩散过程。

小分子和大分子的界定依膜的种类不同而划分范围不同。例如：对于鸡蛋膜来说，葡萄糖分子就是大分子物质；而对于透吸管来说葡萄糖是小分子物质；对于肠衣来说，碘及葡萄糖是小分子物质，而淀粉是大分子物质。