油包水pcr純化

1. PCR產物純化時 用的是什麼純化，擴增完直接純，還是要跑膠

pcr產物是用膠回收試劑盒還是直接pcr產物純化試劑盒
不是的，pcr純化試劑盒—是直接水溶解的pac產物就可以回收，回收效率高，但是只適合單一條帶需要純化測序的時候使用。
pcr凝膠試劑盒—是在pcr產物是混合物，有多條雜帶的情況下，先跑膠將雜帶分離，然後在將你所要的條帶位置的膠切下回收，後者的回收效率低，但是很純凈。pcr產物純化試劑盒去除的是pcr反應體系中的離子、dntp、引物以及聚合酶，收集其中的dna片段。這只適合於幾乎沒有非特異性條帶的pcr產物的收集。如果你的pcr產物具有非特異性條帶，那麼一定需要使用膠回收試劑盒。

2. 如何純化pcr產物或粗提的dna

DNA純化的步驟是：

1.2-25倍100%的酒精冰箱中先預冷，降溫後再加入DNA中；

2.低溫，冰中反應5min至更長時間；

3.低溫，離心；

4.加70%乙醇清洗兩遍；

5.加TE溶解DNA.

3. 用於與載體連接的pcr酶切產物是如何純化的

跑膠後找到目的片段，切膠回收，純化的傳統法就是將PCR產物加入2倍體積的乙醇－20度沉澱過夜後低速短暫離心（如 3000rpm離心1~2min)，棄掉上清，然後用70%乙醇洗滌一次後，棄掉乙醇，放干後再用無菌水或者TE溶解。當然這種方法對PCR產物純化後回收率是很低的，你需要多做幾管PCR，然後一起純化回收。
但是現在實驗室一般都是用PCR產物純化試劑盒，回收純化的效果要好得多。

4. 如何純化PCR產物為什麼總是不純

你說的是PCR產物的純化吧？
先用溶液溶解含DNA的瓊脂糖凝膠，然後加入有吸附柱的離心管中
吸附柱吸附DNA
離心，將含瓊脂糖的溶液去除；
接下來加入去鹽的漂洗液進一步去除雜質；因PH值的原因，DNA還是吸附在吸附柱上的膜上；
最後加入純水或者TE溶解液，在這個條件下DNA會溶解在其中，通過離心將液體離下來，得到的液體就是純化好的PCR產物了

5. PCR純化的原理

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。

6. PCR純化的意義

使在PCR過程中擴增出的目的片段在得率上提高、特異性增強、濃度上提高等，說白了就是是最終產物的純度增加，以便提高後續實驗的成功率。
純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化。蛋白的分離純化常見方法，離子交換、分子篩、疏水層析、親和層析等。

7. PCR擴增目的基因以後，怎麼用瓊脂糖電泳回收及純化呢希望高手指教！

可以用回收試劑盒。舉例如下：
DNA的回收使用AXYGEN公司AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，回收步驟如下：
1、 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體並切碎。計算凝膠重量（提前記錄1.5 ml離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如100 mg=100 μl體積）；
2、 加入3個凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻後於75 ℃加熱，,間斷混合（每2-3 min），直至凝膠塊完全融化（約6-8 min）；
3、 加0.5個Buffer DE-B，混合均勻；
4、 吸取步驟3中混合液，轉移到DNA制備管（置於2 ml( 試劑盒內提供)離心管）中，12,000×g離心1 min，棄濾液；
5、 將制備管置回2 ml離心管，加500 μlBuffer W1，12,000×g離心30 s，棄濾液；
6、 將制備管置回2 ml離心管，加500 μlBuffer W2，12,000×g離心30 s，棄濾液，用同樣的方法再用700 μl Buffer W2洗滌一次12,000×g離心1 min；
7、 將制備管置回2 ml離心管，12,000×g離心1 min；
8、 將制備管置於潔凈的1.5 ml離心管（試劑盒內提供）中，在制備膜中央加25-30 μlEluent，室溫靜置1 min，12,000×g離心1 min洗脫DNA。
如果片段較大，如幾千kb以上建議用promega公司的回收試劑盒這樣效果較好。
具體的步驟什麼的回收試劑盒裡均有說明書。

8. 基因測序，pcr對純水有什麼要求

PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點. 試驗試劑 PCR擴增的雙鏈DNA模板長約20個核苷酸的DNA引物 DNA聚合酶測序膠 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L) 測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl 終止緩沖液：95% 甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈試驗步驟： 1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用. 2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s. 3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的DNA鏈. 4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液. 5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的准確性較低. 2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩餘的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化. 3.?測序引物設計原則類似於PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後,即可用作測序引物. PCR循環測序法 PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該方法採用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子. PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理.由於PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視. 試驗試劑： DNA測序試劑盒 dNTP ddNTP 丙烯醯胺雙丙烯醯胺尿素 TEMED(N,N,N『,N』-四甲基乙二胺) 過硫酸銨 6%測序膠：6%丙烯醯胺,7mmol/L 尿素,1×TBE. 10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP 終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) 終止緩沖液：95%甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈試驗步驟 1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上. 2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中. 3、 反應液上加30μl的石蠟油. 4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數. 5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩沖液並用加樣槍混勻. 6、 上樣前將樣品在大於80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收後,用於序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應後剩餘的dNTP和引物後,用於序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標准方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗. 2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物. 3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用於循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.

9. PCR產物是用膠回收試劑盒還是直接PCR產物純化試劑盒

如果確定PCR產物很純（沒有引物二聚體），完全可以用PCR產物純化試劑盒。

如果PCR產物不是很純，或者PCR擴增條帶比較小，PCR產物前面又有較多引物二聚體時，用膠回收，其餘用PCR產物純化試劑盒。

pcr純化試劑盒和膠回收試劑盒的區別：

PCR純化試劑盒：是直接水溶解的PAC產物就可以回收，回收效率高，但是只適合單一條帶需要純化測序的時候使用。

PCR凝膠試劑盒：是在PCR產物是混合物，有多條雜帶的情況下，先跑膠將雜帶分離，然後在將所要的條帶位置的膠切下回收，後者的回收效率低，但是很純凈。

膠回收試劑盒操作步驟：

1. 配製瓊脂糖EB凝膠,電泳以分離DNA片段。任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用。

2. 電泳足夠時間後，在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來。並盡量去除多餘的凝膠。

3. 稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中並稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為1g/ml，於是凝膠的體積與重量的關系可按下面換算：凝膠薄片的重量為0.2g 則其體積為0.2ml；加入等倍凝膠體積的Binding Buffer，把混合物置於55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3分鍾混勻一次；

4. 轉移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個HiBindTM DNA柱子，並把柱子裝在一個干凈的2ml收集管內，室溫下，10,000×g離心1min，棄去液體。

5. 將柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室溫下，10,000×g離心 1分鍾，去棄濾出液；這一步相當關鍵，不要忽略此步。

6. 將柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鍾，去棄濾出液；註：SPW Wash buffer在使用前必須按瓶子標鑒要求用無水乙醇進行稀釋。

7. 將柱子重新套回收集管中，重復加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鍾，去棄濾出液；

8. 棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10,000×g離心1min以甩干柱基質殘余的液體。

   這步可以去除柱子基質上殘余的乙醇，不要省略此步―――對得到好的DNA產量是十分重要的。

9. 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1分鍾，離心管中的溶液就是純化的DNA產物，保存於-20度。

10. PCR產物純化時 用的是什麼純化，擴增完直接純，還是要跑膠

那要看你的PCR產物有沒有非特異性帶，如果你PCR產物跑膠後很純的只有一條帶（不算引物二聚體），那麼就不需要切膠純化，傳統法就是將PCR產物加入2倍體積的乙醇－20度沉澱過夜後低速短暫離心（如 3000rpm離心1~2min)，棄掉上清，然後用70%乙醇洗滌一次後，棄掉乙醇，放干後再用無菌水或者TE溶解。當然這種方法對PCR產物純化後回收率是很低的，你需要多做幾管PCR，然後一起純化回收。所以你最好去買PCR產物純化試劑盒，這個方法現在只是沒有試劑盒的情況下應急的。如果是PCR產物跑膠後有兩條以上的帶，那麼你就得切膠回收目的片段，推薦這個時候還是買切膠回收試劑盒，傳統法不是沒有，但現在用的太少。如果有興趣了解，歡迎追問。 但無論哪種情況，純化前後都需要跑電泳的。