純化後的蛋白用蒸餾水稀釋

① 蛋白質如何稀釋

用原緩沖液稀釋。

② 為什麼配置蛋白質溶液時要用生理鹽水稀釋而不用蒸餾水

用蒸餾水稀釋應該也沒太大問題，如果稀釋前蛋白質溶液也是蒸餾水的話。
但如果原來是生理鹽水的話，最好還是用生理鹽水，主要是擔心溶液環境變化導致蛋白結構的變化。

③ 為什麼利用透析法純化蛋白時，為什麼不能用蒸餾水做透

防止鹽離子濃度突變，蛋白變性。

④ BCA蛋白定量法BSA及樣品用什麼稀釋

一般來說BCA蛋白定量法中的BSA及樣品都是用蒸餾水稀釋就可以了。假如沒有蒸餾水，也可以用過濾除菌的去離子水代替也是沒有太大問題的。

⑤ 向析出的球蛋白中加入蒸餾水是否溶解

不會溶解但會稀釋。

⑥ 求分離，純化,鑒定γ球蛋白的具體方法（包括原理，步驟，預期結果，注意事項）謝謝

[原理]

血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約佔16％，100ml血清中約含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉澱分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉澱析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離,沉澱部分即為含有γ-球蛋白的粗製品。

用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗採用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG--25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而後洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。

脫鹽後的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的α－球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的γ－球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ－球蛋白，從而使γ－球蛋白粗製品被純化。其反應式如下：

用上述方法分離得到γ－球蛋白是否純凈，單一？可將純化前後的γ－球蛋白進行電泳比較而鑒定之。

[操作]

(1)鹽析――中性鹽沉澱：取正常人血清2.0ml於小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻後於室溫中放置10min，3000r／min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，於沉澱中加入0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即為粗提的γ－球蛋白溶液。

(2)脫鹽――凝膠柱層析

①裝柱

洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。

②上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。

加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉澱即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑應用液l滴，以觀察NH4+出現的情況。

合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。

(3)純化――DEAE纖維素陰離子交換層析：用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。

(4)濃縮――經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。

(5)鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳 取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽後的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點上。然後參閱實驗二十四：乙酸纖維薄膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。

[注意事項]

(1)凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。

(2)裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

(3)本法是利用γ-球蛋白的等電點與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。

(4)電泳注意事項見實驗二十四。

(5)凝膠貯存：凝膠使用後如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉。保存於4℃冰箱內。若長期不用，應脫水乾燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干後，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最後一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然後用多孔漏斗抽干後，於60～80℃烘乾貯存。

(6)離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用後只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、鹼處理，最後用水洗至接近中性。陽離子交換劑最後為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為鹼一水一酸一水。由於上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強鹼長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3-4h。

離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。

除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然後倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結紮好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出後，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，並在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。

濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用後(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10℃以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG一25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。

[試劑]

(1)飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g，置於1000ml蒸餾水中，在70一80℃水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。

(2)葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠 25g。稱取所需量置於錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30ml，用玻璃棒輕輕混勻，置於90～100℃水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h後取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可於室溫中浸泡24h，攪拌後稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2～3次，然後加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE纖維素14g稱取，每克加0.5mol／L鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉後，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌後放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然後加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(4)0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)

A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)2.730g溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。

B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至 1000mL。

取A液77.5ml，加於B液22.5ml，混勻後即成。

(5)20%磺基水楊酸溶液

(6)奈氏(Nessler)試劑應用液

①貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58於250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振搖10min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉澱，洗滌液一並倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100ml。

②應用液：取貯存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

(7)0.9％氯化鈉溶液

(8)乙酸纖維素薄膜電泳有關試劑(見實驗二十四)

(四)親和層析

生物體中許多高分子化合物之間具有專—性可逆結合的特徵，例如：酶蛋白和輔酶，抗原和抗體，激素與受體，核糖核酸與互補的脫氧核糖核酸等。生物分子間的這種專一性結合能力稱為親和力，根據生物分子間親和力大小產生吸附和解吸作用而建立的層析方法稱為親和層析。

親和層析的基本過程如下：具有親和力的一對分子，其中一種分子作為配基，固定化結合在不溶性載體上裝入層析柱成親和柱，當含有另—種分子的混合液作為流動相流入親和柱時，能與配基親和結合的分子被吸附，其它雜質直接流出，再改變流動相的溶液，使配基與其親和物解離從而解吸出待分離的分子來。

親和層析中最常用的具有親和力的生物體系有：

酶：底物、抑制劑、輔酶

抗體：抗原、病毒、細胞

外源凝集素：受體、載體蛋白

細胞：細胞表面特異蛋白，外源性凝集素

⑦ 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

⑧ 蛋白質加蒸餾水搖勻沸水浴會發生什麼變化

化學反應。有的蛋白質溶於水，他們是以膠體狀態存在的，而加入蒸餾水中搖勻沸水浴，蛋白質會沉澱析出，發生了鹽析，蛋白質受熱會發生凝固。

⑨ 純化的蛋白迅速降解原因

有的蛋白質在常溫常壓下是不能成功純化的，因此你首先應該了解你的目的蛋白。
我們比較幸運能在常溫常壓下純化，就我們的經驗來說：1.純化所用的玻璃器皿一定要徹底清洗，蒸餾水沖洗後140度以上高溫烘乾（可以參見普通的實驗室手冊）， 其他可高壓滅菌的高壓滅菌，或用一次性的。這些是最基本的。2.緩沖液中可以加入b-ME或DTT，不過DTT比前者貴得多。3.EDTA常規都加。4.如果你的樣本很少又珍貴並且不怕花錢的話，可以聯合使用兩種以上的蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)(protease inhibitor)（類似cocktail 的方法）如pepstatin、PMSF、leupeptin等，根據情況吧。5.如樓上所說，沒有層析櫃，可以用一個透明門的冰箱代替；有的實驗室有4度冷庫，可以直接在裡面操作，很不錯。6.樣品保存也很關鍵，上樣前收集後都須低溫保存，一旦鑒定完了就分裝凍起來，或是製成乾粉，避免反復凍融。
甘油沒有用過，你還是在查查吧。
不過各種類型的介質都有流量流速限制，這就不用說了。離子交換柱好像對速度的要求更加嚴格吧？這一點還請樓上的指教。
除了本身純化過程需要注意以外,也特別小心前面處理的過程,例如超聲破碎時間及強度,如果過強和時間長也可能斷裂,我覺得得從提取開始檢測到底是什麼原因,同時看一下蛋白的穩定性,如果是保存你的降解帶沒有明顯變化,那就不一定是自己降解的,也許是處理或者純化過程造成的,總之要全面監測,好知道到底是什麼原因,才好找到相應的辦法.
甘油是有一定的作用,但是如果是純化加的話,那最好別超過10%,否則太粘根本流不動,而且也許蛋白會沉澱堵柱子,還需要考察不同的鹽對降解的影響,我知道有的時候高鹽也可以抑制降解,還有注意pH,而且可以加點EDTA看看.因為不少酶需要金屬離子活性更高.