dna能不能穿過高效過濾器

㈠ 初效、中效、高效過濾器之間有什麼區別

初效，中效，亞高效，高效空氣過濾器有什麼區別初效又稱粗效，主要是保護下一個過濾段中回效，答中效就是保護下一個過濾段高效。主要的區別：材質不同，過濾級別不同。如果高效段前不安裝初中效那麼高效就會在很短的時間內報廢，中效也一樣。

㈡ 高效空氣過濾器有什麼作用 對人體是否有傷害

導語：當今社會環境污染越來越嚴重了，各種汽車的尾氣，裝修房屋的氣味等都需要清除，大多數人都會想到購買高效空氣過濾器，因為高效空氣凈化器過濾效果高，而且容塵量很大，適合大工業作業量的場所，有效保護呼吸健康，高效空氣過濾器是工業場所使用率很高的一種空氣凈化設備，那麼這種空氣過濾器有什麼作用呢?隨小編一起看一看。

高效空氣過濾器—簡介

高效空氣過濾器主要用於捕集0.5um以下的顆粒灰塵及各種懸浮物。採用超細玻璃纖維紙作濾料，膠版紙、鋁膜等材料作分割板，與木框鋁合金膠合而成,採用特殊硅橡膠作,無氣味,表面不會硬化,時間長也不會有裂紋,化學性能穩定，耐腐蝕，可吸收熱脹冷縮產生的應力而不會開裂，軟硬度適中，彈性恢復好。

每台均經鈉焰法測試，具有過濾效率高、阻力低、容塵量大等特點。高效空氣過濾器可廣泛用於光學電子、LCD液晶製造，生物醫葯、精密儀器、飲料食品，PCB印刷等行業無塵凈化車間的空調末端送風處。高效和超高效過濾器均用於潔凈室末端，以其結構形式可分為有：有隔板高效、無隔板高效、大風量高效,超高效過濾器等。

高效空氣過濾器——作用

高效空氣過濾器潔凈技術控制過濾的灰塵一般是0.110m的塵埃粒子，粒徑較小，包含有固態微粒和液態微粒;大氣中懸浮的有機微粒有微生物、植物的花粉、花絮與絨毛，微生物一般包括病毒、立克次氏菌、細菌、菌類、原生蟲和藻類。高效空氣過濾器控制的主要是細菌和菌類、病毒。

因為微生物主要附著在塵埃粒子上，因此將空氣中的塵埃粒子有效地控制，也就能有效地控制空氣中的細菌、菌類及病毒。要做到這一點，必須通過阻隔性質的微粒高效空氣過濾器，方可加以過濾。一般地，普通高效空氣過濾器對細菌的過濾效率可達99.996，基本上可以滿足生物潔凈室的過濾凈化要求。

高效空氣過濾器——對人體是否有傷害

高效空氣過濾器對人體是有好處的，很多經常在無塵車間上班的員工經常會有疑問：經常在無塵車間里工作，裡面的空氣對人體會不會有影響呢?答案當然是否定的，我們都知道，無塵車間里的空氣主要是經常末端的高效空氣過濾器進行過濾過後才送到室內的，員工所說的空氣主要就是指經過高效空氣過濾器過濾後的空氣。

高效空氣過濾器本身是由極細的玻璃纖維紙製作而成，本身的過濾精度可以達到99.99%過濾0.3um以上，也就是說大氣中的大部分能看到的和不能看到的塵埃包括細菌載體等都被過濾掉了才送到無塵車間內部的，員工所吸收的空氣其實比外界要干凈很多，因此高效空氣過濾器總體而言，對人身體是有好處的。

結語：空氣凈化器主要由濾芯和殼體兩部分組成。基本要求是過濾效率高、流動阻力低、能較長時間連續使用以降低後期耗材成本。其中濾芯即是指空氣過濾器，高效空氣過濾器在空氣凈化行業中起著至關重要的作用，它能夠捕捉到空氣中的有害顆粒、灰塵雜質，並對其進行殺菌凈化，讓空氣還原潔凈。關於高效空氣過濾的相關內容就介紹到這里了，希望能幫助到大家。

㈢ DNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些

質粒抽提流程詳解——沉澱菌體
檢查細菌培養情況，將明顯渾濁的菌液倒在已經編號的2ml的沉菌用離心管里，在約12000轉/min的速度下離心沉澱1分鍾，保證無懸浮物後取出；將離心管倒扣在衛生紙上，用力敲擊，至液體培養基完全去除；如發現菌體沉澱的少，可多加2ml菌液重復沉菌一次。
在離心管中加入250µl 加過RNaseA1酶的Buffer S1，用振盪器震盪，直到沉澱完全充分懸浮。
1. Buffer S1是什麼？主要組分是什麼？
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0

2. Buffer S1的功能是什麼？
50 mM葡萄糖：加了葡萄糖後最大的好處只是懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果Buffer S1中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。
EDTA ：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在Buffer S1中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。 ——但是對於測序而言，我們是用水溶解質粒，所以EDTA是必須的。

3.如果抽提質粒恰好Buffer S1用完了，可不可以用水代替？
只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。

質粒抽提流程詳解——裂解
在離心管中加入250µl Buffer S2，上下緩慢顛倒7~8次至混旋液澄清（這步的操作時間不得超過4分鍾）；
☆ 注意：顛倒時不能太劇烈，否則會有核DNA污染；如果Buffer S2因溫度過低有SDS沉澱析出，可將其放置55~60C水溶鍋中適當加熱至澄清後再用。
1.抽提質粒的原理是什麼？
鹼裂解法

2. Buffer S2是什麼？主要組分是什麼？
0.2 N NaOH / 1% SDS
SDS：十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），是洗潔精的主要成分。常用於DNA提取過程中使蛋白質變性後與DNA分開。

3.Buffer S2的功能是什麼？
NaOH：NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了鹼都會幾乎在瞬間就溶解。用了不新鮮的NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是鹼性的，只是弱了點而已。
4.加入Buffer S2為何時間不能太久，動作要輕柔？
第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。

質粒抽提流程詳解——中和
加入400ul Buffer S3，劇烈顛倒5~10次，使之充分中和，同時將大塊白色沉澱振成小塊，便於離心。
在約13600轉/min的速度下離心沉澱12分鍾，如有因沉澱不完全引起的白色絮狀物質，可重復振盪離心直至沉澱完全。
1. Buffer S3是什麼？主要組分是什麼？
3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸

2.加入Buffer S3後出現的白色沉澱是什麼？&3.Buffer S3的功能是什麼？
每個人都知道，溶液III加入後就會有大量的沉澱，但大部分人卻不明白這沉澱的本質。
最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性後發生的沉澱。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉澱的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉澱，那會不會是遇鹽發生的沉澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉澱。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。如此看來，溶液III加入後的沉澱實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉澱更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了，與此同時大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了。這個過程不難想像，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了，盡管SDS並不與DNA分子結合。

2 M的醋酸的作用是什麼？
是為了中和NaOH，因為長時間的鹼性條件會打斷DNA，所以要中和。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了。所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

質粒抽提流程詳解——純化
將上步離心上清液用移液器轉移到吸附柱上，在約10500轉/min的速度下離心1分鍾。
注意：不要把沉澱物轉移到吸附柱里，1個樣品使用1個槍頭。

為何離心上清液經離心後，質粒DNA就被吸附到膜上？
在高鹽狀態下，硅膠膜專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態下，DNA被洗脫下來。

質粒抽提流程詳解——洗滌脫鹽
取出DNA吸附柱，棄掉廢液收集管中的液體，將柱子放回這個離心管中，加入500ul Wash Solution到柱子中，高速離心（10,000rpm)30秒。
重復上述步驟一次。
取出DNA吸附柱，棄掉廢液收集管中的液體，將柱子放回這個離心管中，最大速度離心2分鍾
使用Wash Solution要進行兩次洗滌，目的是使殘留的蛋白、鹽離子等雜質更充分的被去除，保證硅膠膜上吸附的DNA盡量純。

質粒抽提流程詳解——產物回收
將DNA吸附柱移入新的1.5ml離心管中，在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 預熱無菌雙蒸水，室溫放置2分鍾後12，000rpm離心1分鍾，離心管底即為質粒DNA。

㈣ 空氣凈化器具體有什麼作用

空氣凈化器作用可大了，營造一個健康的室內環境肯定是有用的咯。比如家裡養寵物的，總會有皮毛和小細菌。再比如傢具、油漆什麼的散發出來的甲醛，對健康可是危害很大的。我家用的是三星等離子空氣凈化器 MPI（AC-505CMAGA/SC） 系列，看中的就是三星獨創的 SPi殺菌技術，是通過醫學機構認證的，信得過。另外它的三重高效過濾器能過濾灰塵、動物皮毛、甲醛等有害物質。其中的一個 DNA 除臭過濾器更是能吸附致癌物質。家裡用到現在，一直覺得好，整個環境都覺得舒適了很多，你說有用不？嘿嘿

㈤ 生物安全櫃的超高效過濾網怎樣定期檢查有什麼要求

生物安全櫃高效過濾器檢漏方法

隨著生物技術的深入研究和其應用領域的不斷擴大，生物安全越來越受到高度重視。由於生物技術的操作處理對象都是微生物、活細胞之類的有機體，或者是它們的重組體、變異體，在對其試驗研究的各環節中，既有可以治療疾病、改善生活、治理環境的積極作用，也存在著可能引發傳染疾病、危害操作人員健康以至影響環境的消極因素。特別是在基因工程的實驗研究中，存在著難以預知的潛在危害。因此，評價危害程度， 研究控制方案、設計防範措施，制定管理法規就顯得非常重要。生物安全的關鍵是既要控制具有潛在危害的操作對象「由內向外地對周圍環境釋放，又要控制外界環境的有害因子「 由外向內地對操作對象的入侵，因此，生物安全防護系統直接關繫到周圍環境及操作人員的安全。

１ 生物安全防護措施

１．１ 屏障控制

為了達到生物安全的目的，除了通過生物控制及嚴格操作技術、高度重視安全教育外，更為常用的方法是精心設計防護設備和實驗設施，對生物危害採用封閉設備和隔離設施組成的屏障來控制，使操作人員和周圍環境得到更加完善的保護。在生物安全實驗室里設有一級屏障和二級屏障兩道防線（確保實驗人員的 安全、實驗室周圍環境的安全及實驗對象對環鏡的要求），一級屏障（生物安全櫃，帶有罩殼的離心機，超聲振盪器等）發揮著主要的屏障作用，保護操作人員。二級屏障（ 整個實驗室的壁、地坪、天花板等建築構件和凈化系統設施） 是一級屏障的外圍設施， 能夠在一級屏障失效或其外部發生意外時， 使其他的實驗室及周圍人群不致暴露於釋放的實驗材料之中而受到保護［１］。

１．２ 排風系統的作用

實驗室二級屏障是通過送、排風的有效控制，發揮其安全保護作用，其安全的核心措施是通過排風保持負壓，保證周圍環境不受染污。當室內有致病因子泄漏時，排風高效過濾器就起著至關重要的作用，若高效過濾器泄漏，致病因子將隨排風逸到室外，對室外環境造成巨大的污染，後果非常嚴重［２］。

２ 排風高效過濾器檢漏

２．１ 檢漏方法的可行性

在 ２００４ 年 ８ 月 ３ 日發布的《 生物安全實驗室建築技術規范》ＧＢ５０３４６－２００４（以下簡稱《 規范》）中要求：「 ５．３．２ 三級和四級生物安全實驗室的排風必須經過高效過濾器過濾後排放，高效過濾器的效率不應低於現行國家標准《 高效空氣過濾器》ＧＢ１３５５４中的 Ｂ 類［２］。《 規范》條文說明：「 ５．３．８ 由於排風是安全措施的核心， 如果排風過濾器有漏泄，就不能把住這道關，不僅排風形同虛設，而且更加危險，以致於此安全實驗室也形同虛設了。所以，如果不能確認排風過濾器不漏，則此實驗室不能啟用［２］。……可見對排風高效過濾器的檢漏的重要性，這是關繫到實驗室能否啟用的關鍵。所以在《 規范》中，第 １０．１．６ 條規定「 高效過濾器應按表：１０．１．６ 的要求進行檢漏和評價［２］。

㈥ 初、中、高效過濾器凈化等級和相應的作用

初效自過濾器介紹和作用

初效過濾器是空調系統的初級過濾，主要用於過濾 5μm 以上塵埃粒子。初效過濾器有板式、折疊式、袋式三種樣式。

初效過濾器介紹和作用

中效過濾器主要用於中央空調通風系統中級過濾、制葯、醫院、電子、食品、等工業凈化中；還可做為高效過濾的前端過濾，以減少高效過慮的負荷，延長其使用壽命；

迎風面大，空塵量大、風速低，被認為是最好的中效過濾器結構。

初效過濾器介紹和作用

高效過濾器主要用於捕集0.5um以上的顆粒灰塵及各種懸浮物，作為各種過濾系統的末端過濾。

初效、中效、高效過濾器作用的區別

1.精度不同：高效過濾器精度最高，初效過濾器精度最低；

2.安裝位置不同：過濾器以「先粗後精」原則組合配置，順序不能顛倒。初效過濾器在最前面，中效過濾器在中間，高效過濾器在最後面。

㈦ 急求！！DNA測序的問題

DNA測序技術
DNA sequencing technology
在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、 A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
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二、材料
待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
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三、設備
高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。
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四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
（2）丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V)：95g丙烯醯胺，5g甲叉雙丙烯醯胺溶於140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶於4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶於2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步驟
：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，並且注意如下幾點：
（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。
（2） 分光光度法對於很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，並不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。
（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳後DNA樣品的前面，並不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物鹼基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾。然後： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鍾(延伸)。
模式2:適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾, 然後: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
（二）、 測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
C. 4-5分鍾後, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多餘的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。
2. 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染, 用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，並用0.45mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4-6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。
凝膠終濃度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
（三）電泳：
1、預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
[注意]
（1）. 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
（2）. 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2、樣品的制備：
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4- 6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小於0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3、上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、 T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40-60V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55cm長， 0.2mm厚的凝膠板，在2500V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
[注意]
1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
（四）、 測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振盪)。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影：
(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配製。
(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鍾,或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
[注意] 測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響。
1. 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。
2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。
3. 染色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯醯胺濃度高於4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
5. 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10-12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。

㈧ 潔凈區高效過濾器接住什麼,孔徑多少,能截留菌嗎

高效過濾器有溶菌酶空氣過濾器，這個是濾紙生產的時候直接的圖層。高效過濾器的最易穿透粒徑是0.3微米，超高效的最易穿透粒徑是0.12微米。。。且根據其過濾等級不同攔截率也不同。
高效過濾器的孔徑多少這個沒辦法計算，高效過濾器一般是採用玻璃纖維的，就是把玻璃抽絲用膠粘合成一起的，測試的時候只是測試其過濾率。就是所說的等級。
你要是有啥問題可以直接給我發私信，我就是做空氣過濾器銷售的

㈨ DNA測序的測序技術

高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（Next-generation sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析儀(即DNA測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個鹼基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的熒光，並在CCD攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色列印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟體。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由於該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、准備工作
1. BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒游標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4. DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1 μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配製成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc·3H2O溶於70 ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌後分裝。
9. 70%乙醇和無水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10×電泳緩沖液 。
14. 全自動DNA測序儀。
15. PCR儀。
16. 台式冷凍高速離心機。
17. 台式高速離心機或袖珍離心機。
二、PCR測序反應
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標准對照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待測的質粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 μl
待測DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
滅菌去離子水 2 μl 2 μl
總反應體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置於9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min後進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環，擴增結束後設置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
1. 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振盪，置冰上10 min以沉澱DNA。12 000 r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉澱2次。12 000 r/min於4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空乾燥沉澱10～15 min。
四、電泳前測序PCR產物的處理
1. 加入12 μl的TSR於離心管中，劇烈振盪，讓其充分溶解DNA沉澱，稍離心。
2. 將溶液轉移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。
五、上機操作 1. 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。2. 儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。3. 電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。4. 每一個樣品電泳總時間為2.5 h。5. 電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
六、序列分析 儀器將自動進行序列分析，並可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異鹼基處，提高工作效率。
七、儀器清洗 測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
八、計算
1. 測序反應精確度計算公式：100%－差異鹼基數(不包括N數)/650×100%。
2. 差異鹼基即測定的DNA序列與已知標准DNA序列比較不同的鹼基，N為儀器不能辨讀的鹼基。 SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物（<500bp）得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03～2pmol模板DNA，隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA（dsDNA）模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板（如PCR反應產物）快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
一、試劑准備
1. SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
2. 丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V）：95 g丙烯醯胺，5 g甲叉雙丙烯醯胺溶於140 ml 雙蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
3. 10%過硫酸銨，0.5 g過硫酸銨溶於4 ml水中，定容至5 ml，應新配新用。
4. 10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
5. TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
8. 染色溶液：硝酸銀2 g，甲醛3 ml，溶於2升超純水中備用。
9. 顯影溶液：60 g碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸鈉溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、測序反應
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml適當的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（約20 μl）礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應，在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA ：2.1 pmol
5×測序緩沖液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
無菌ddH2O 至終體積16 ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf（+）對照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×測序緩沖液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml測序級Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以【注意】中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3 μlDNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
【注意】
（1）測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200 bp（PCR產物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋質粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
（2）計算與4.5 pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n為引物鹼基數
計算與1p mol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n為模板鹼基對數
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n為模板鹼基數
（3）為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾，然後： 95℃ 30秒（變性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分鍾（延伸）。
模式2：適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾，然後：95℃ 30秒（變性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
三、測序凝膠板的制備
1. 玻璃板的處理
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高（棕色）。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鮮的粘合溶液。
② 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板，整個板面都必須擦拭。
③ 4～5分鍾後，用95%乙醇單向擦玻璃板，然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程，每次均須換用干凈的紙，除去多餘的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷，使凝膠不能很好地粘附。
② 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的，否則將導致凝膠撕裂。
（2）長玻璃板的處理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
② 5～10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10%NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染，用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開，如果出現交叉污染，以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2. 凝膠的制備
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%～8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2 ml，並用0.45 mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4～6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。
（3）膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
② 灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
四、電泳
1. 預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30 V/cm的電壓預電泳20～30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
【注意】
① 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
② 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2. 樣品的制備
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1～3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4～6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4 mm。厚度小於0.4 mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3. 上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30 V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40～60 V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55 cm長，0.2 mm厚的凝膠板，在2500 V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28 mA降至25 mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
【注意】
① 上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
② 一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
五、測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠（連玻璃板）放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒，充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜（不振盪）。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出，當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10～20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影
（1）在顯影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸鈉溶液（400 μl）以完成顯影液的配製。
（2）從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5～10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5～10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長，可重復第五步用染色液浸泡。
（3）立刻將凝膠轉移至1升（總量的一半）預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶，把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2～3分鍾或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應，固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景（如紙）上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
【注意】
測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響
① 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水（NANOpureR或Milli-QR的水）或雙蒸水可獲得較好的效果，如果水中有雜質，則低分子量條帶可能無法出現。
② 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可獲得較好的結果。
③ 色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA，產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
④ 如果凝膠厚度超過0.4 mm或丙烯醯胺濃度高於4～6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4 mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
⑤ 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10～12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。
六、EDF膠片顯影
使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數據轉移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉移至EDF膠片之後可增強條帶可讀性。
1. 在暗室內，將染色過的粘於玻璃板的凝膠（膠面向上）置於熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間，用一小條EDF膠片曝光不同時間，檢查不同的曝光強度，一般曝光20～40秒可得較好結果。
2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角，然後把膠片置於凝膠上，使缺口位於左上角。由於EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。
3. 在EDF膠片上放置一干凈、乾燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。
4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程：
（1） 在Kodak GBX顯影液中顯影1～5分鍾；
（2） 水洗1分鍾；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分鍾；
（4）水洗1分鍾。
【注意】
① 進行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全乾燥。戴手套進行操作，以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。
② 對於不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。
③ 曝光時間短則EDF膠片影像較深，曝光時間長則有助於減弱背景。 「鳥槍法」是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合，將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。
這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。可以說這是利用「溜散彈射擊」原理去「命中」某個基因。由於目的基因在整個基因組中太少太小，在相當程度上還得靠「碰運氣」，所以人們稱這個方法為「鳥槍法」或「散彈槍」實驗法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，並用Agarose凝膠電泳進行回收。
二、對回收的大片段DNA用物理方法（如超聲波等）進行切斷處理，然後用T4DNAPolymerase對小片段DNA進行末端平滑化。
三、進行Agarose電泳，切膠回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然後用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一個A鹼基。
四、把加上A-tail的DNA片段連入T-Vector中，然後轉化，挑選克隆。
五、對陽性克隆（含1kbp～2kbpInsert）進行DNA測序。
六、對數據進行編輯，最後連成一條大片段的DNA序列。