離子交換柱層析注意事項

『壹』 急求：離子交換柱層析分離氨基酸的講義

一、目的

學慣用陽離子交換樹脂柱分離氦基酸的操作方法和基本原理。

二、原理

各種氨基酸分子的結構不同，在同一PH時與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達到分離的效果。

三、器材

1、20cmX 1cm層析管 2、試管

3、吸管． 4、恆壓洗脫瓶

5、部分收集器 6、搪磁杯

7、電爐 8、分光光度計

四、試劑和材料

1、．苯乙烯磺酸鈉型樹脂（強酸 lx 8，l00一200目，可用上海華東化工學院產品）

2 、2 mol／L鹽酸溶液

3、2mol／L氫氧化鈉溶液

4、標准氨基酸溶液 天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸均配製成 2 mg／mL的0.1M鹽酸溶液。

5、混合氫基酸溶液將上述天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合。

6、檸檬酸－氫氧化鈉一鹽酸沖液（pH5.8），鈉離子濃度0 .45M）

取檸檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、氫氧化鈉9.30g和 濃鹽酸 5．25 mL溶於少量水後，定容至 500 mL，冰箱保存。

7、顯色劑 2 g水合茚三酮溶於 75mL乙二醇單甲醚中．加水至 100 mL。

8、50%乙醇水溶液

五、操作

1、層析柱的准備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型後洗至中性（處理方法見第三篇實驗十二）．攪拌一小時後裝成一個直徑1cm．高 16～18 cm的層析柱。

2、氨基酸的洗脫：用P H5.8的檸檬酸緩沖液流洗平衡交換住（裝置如圖）。調節流速為 0.5 mL／min，流出液達床體積的4倍時即可上樣。由柱上端仔細加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，即刻加入0.5 mL擰檬酸緩沖液沖洗加樣品處。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時。再加入0．5 mL緩沖液。如此重復兩次，然後用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面），並將柱與洗脫瓶和部分收集器相連。開始用試管收集洗脫液，每管收集lmL．共收集60一80管。

3、氨基酸的鑒定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮顯色劑並混勻，在沸水浴中淮確加熱15分鍾後冷卻至室溫．再加15 mL的50％乙醇液。放置10分鍾。以收集液第2管為空白，測定A570nm波長的光吸收值。以光吸收值為縱坐標，以柱洗脫體積為橫坐標繪制洗脫曲線。以已知3種氨基酸的純溶液為樣品，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照．可確定3個峰的大致位置及各蜂為何種氨基酸。

『貳』 離子交換和凝膠層析裝柱時,出現氣泡,結節怎麼處理

可以用適量的有機溶劑潤洗一下層析柱，柱子體積較小的話就用玻璃棒攪勻排除一內下氣泡。

不管是干柱和容濕柱，都要加層析液，不能要求一開始就沒有氣泡的。要用洗脫劑不停的洗脫，就是用配置好的試劑一邊一邊對柱子進行洗脫，這樣不但可以消除氣泡，還可以使硅膠充分沉降，讓層析效果更好。等柱子沒有氣泡後在上樣用洗脫液進行層析。

若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層）時，會影響滲透速度和顯色的均勻。去除就是用玻璃棒攪拌，趕走氣泡。

(2)離子交換柱層析注意事項擴展閱讀：

水溶液中的一些陽離子進入反離子層，而原來在反離子層中的陽離子進入水溶液，這種發生在反離子層與正常濃度處水溶液之間的同性離子交換被稱為離子交換作用。

離子交換主要發生在擴散層與正常水溶液之間，由於黏土顆粒表面通常帶的是負電荷，故離子交換以陽離子交換為主，故又稱為陽離子交換。離子交換嚴格服從當量定律，即進入反離子層的陽離子與被置換出反離子層的陽離子的當量相等。

『叄』 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

先裝部分液體嗎，然後倒入色譜填料（色譜調料配置成懸浮液），倒的時候注意液面在填料上面，防止產生氣泡。色譜柱可以適當放液，增加填料的沉積速度。

『肆』 色譜柱的注意事項

色譜柱 的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
②應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠「飽和」，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然後再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那麼可以省略最後用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200μl四氫呋喃數次有助於除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞碸數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀鹼緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然後用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發乾燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在後兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理後柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。採用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間後，可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間後柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完後，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當採用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完後應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鍾。

『伍』 什麼是層析 有什麼要注意的

在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、 聚醯胺薄膜層析聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

二、 離子交換層析離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`

三、 凝膠過濾凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

四、 親和層析 親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物（S'）才能和一定的酶（E）結合，產生復合物（E－S'）一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體（類似底物）是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰（見圖6－2）。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。

上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。

五、 聚焦層析聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。 聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室（這層析柱者）中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時，先用起始緩沖液（配方見表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質（作流動相）的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為蛋白質所帶電荷取決於它的等電點（PI）和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。

不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。

『陸』 離子交換層析的具體操作

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣：
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度，當A1>A2時為凹形梯度，A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。

『柒』 離子交換柱層析法分離氨基酸實驗裝柱有哪些注意事項

氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑

『捌』 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

1.樣品處理：對被分離樣品有時要經過水解等化學處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.離子交換柱的安裝：層析柱內徑必須粗細均勻，柱管大小可據實際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發泡塑料片以防止交換樹脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.裝柱：⑴裝柱質量是確保柱層析分離效果的技術關鍵之一，越是高技術層析(如使用毛細管層析柱的高級層析設備)裝柱的技術要求和難度越高，以至手工操作很難達到。⑵裝柱的質量要求，無論是手工、機械、自動化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構；⑶裝入柱中樹脂的高度與直徑之比因分離對象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹脂（濕法裝柱）為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進出液管之間、梯度混合器與進液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏（塞子、接頭、活塞開關處在長時間滿負荷下不泄漏），③加隔離緩沖墊（緊貼於柱子下端塞子的內平面），④加少許平衡液於空柱內，⑤趕氣泡（緩沖墊內和出水管中的氣泡），⑥開通放水開關，⑦與放水量保持相當的流速，向柱內勻速加完載體材料漿，⑧關閉放水開關，令樹脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹脂，⑩最後用緩沖液過柱和平衡柱，使樹脂結構平衡穩定，⑾在樹脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，並與柱子內壁保持嚴密接觸，以防加樣時樹脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加樣：緩緩打開柱子下端的放液開關,使柱內液面剛好降至樹脂面時便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進入樹脂層內便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，並隨之進入樹脂層。當柱內液位接近樹脂表面時便立即添加洗滌液進行洗滌操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當的總用量及洗滌流速，小心洗滌柱內樹脂，以除去不被離交樹脂吸附的雜質。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的最佳濃度和適當的總量、操作壓及流速進行洗脫。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.監測：用敏感快速的方法（參見下文「測定」）監測分離成分是否洗脫出來以及洗脫峰的軸向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦發現待分離成分洗脫出來便可進行一步或分步收集，並可根據各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監測，決定產品收集濃度區段，棄去的洗脫液可循環用於相同成分的洗脫。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉澱/離心：用沉澱劑可將分離組分沉澱或離心下來脫水乾燥，沉澱劑回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脫水乾燥：加入適當脫水劑為如無水乙醇、丙酮或乙醚脫水後進一步乾燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.測定：對層析所得產品可稱重或測定活性計算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事項】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.應根據被分離物質的理化性質、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機械強度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規格型號、理化性質、功能作用、活化再生和保養存放等技術參數資料可供用戶選擇。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.應根據分離純化的對象、規模選擇層析柱的長短、粗細、柱高與內徑之比，使達到最佳分離效果；此外，柱子材料的化學性質要穩定、透明，內徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利於緊固、連接、裝柱與維護。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、穩固，與之相連的各種線路、管道、設備、設施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱內樹脂層面平整、層序結構始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術關鍵。為此，從裝柱到洗脫結束的過程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過程中要始終保持柱內液位不低於柱內樹脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內樹脂的層序結構始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時發生「翻缸」而攪亂樹脂層結構，「壓缸」而造成柱層斷裂和梗塞斷流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作壓，這對確保層析柱流速和分離效果十分重要。因為流速不僅與洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關，也與裝柱材料的粒度、交聯度、機械強度有關。應針對具體情況建立一個操作壓、流速和分離效果的最佳平衡點。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.顯著標明各種洗滌、洗脫液的技術參數，嚴禁亂用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.製作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設置洗脫監控點。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破損樹脂，及時補足流失、破損的循環樹脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.嚴格掌握新、舊樹脂的活化、再生條件，及時再生舊樹脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
樹脂的再生：每次洗脫結束，用清水將樹脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹脂經過一段使用後樹脂上的活性基團因被交換而使交換容量大為降低，此時樹脂需要再生處理。( z# |! T+ @) z" O
大處理（酸—鹼—酸）：加入樹脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時，自來水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。
5 F% O1 U$ W2 r小處理（鹼—酸）：濃度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
連續用數次的樹脂進行小處理，用十次後的樹脂要進行大處理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脫水乾燥條件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

『玖』 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用版離子交換柱層析法分離不同的權蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。