㈠ 用超濾離心法測包封率脂質體需不需要稀釋
超濾離心前應該可以根據需要進行稀釋，也可以不稀釋。
超濾離心後，內如果是取收集的離容心液進行檢測的話，建議取離心液進行定量稀釋，比如到固定體積的量瓶中，以便根據稀釋倍數確定離心液中的葯物濃度從而計算包封率。
㈡ 急!!!脂質體粒徑怎麼測比較准確啊
一、脂質體的分離
適當化學結構的親脂性葯物是鑲嵌在雙層膜內而被包裹在脂質體中，其包封率取決於所用脂質的濃度。在這種情況下，包封率可達到90％，就不一定要除去未包裹葯物。但是對水溶性葯物而言，被包裹的葯物僅是總量中的一部分，就必須從脂質體懸液中除去未包裹葯物。由於脂質體比被包裹的葯物分子要大得多，因此可利用它們的不同大小來分離除去未包裹的葯物，這些方法有凝膠過濾柱層析法，滲析法等；若被包裹的物質是蛋白質或DNA，或者未被包裹的葯物可能形成較大的聚結物，則可利用它們與脂質體浮力、密度的不同而採用諸如離心等方法進行分離。
(一)柱層析法
凝膠滲透層析技術廣泛用於從脂質體懸液中分離除去未包裹葯物，也可用於對懸液中的脂質體大小分組，這一技術在實驗室中很有效且快速。在大規模生產上，雖然也可用凝膠過濾來純化，但技術較困難且價格昂貴。另外，脂質體被洗脫介質稀釋後可能需要增加濃縮步驟。
柱層析填料常用葡聚糖如Sephadex G-50，其步驟與常規方法一致。但必須指出：①在葡聚糖表面存在著能與脂質體膜結合並相互作用的微小部位。雖然這種作用並不影響脂質體在凝膠柱上的流動特徵，但仍可導致少量脂質的損失，使膜的不穩定性增加，從而導致膜滲透性的改變及包裹物質的滲漏。這種現象在脂質濃度較低的情況下特別應予注意，一般可通過加大脂質體樣品上柱量或用空脂質體預先將柱子飽和來解決。通常使用20mg脂質製成的小單層脂質體可飽和10g凝膠；②若凝膠顆粒太細，較大的脂質體可能被滯留在凝膠柱上，因此對多層脂質體宜選用中粗級的凝膠(粒徑大小為50～150µm)，而對小單層脂質體則可用任何級別的凝膠。
(二)滲析法
此法是最簡單的也是最常用的除去未包裹葯物的方法(大分子化合物除外)。它不需要復雜的技術，也無須昂貴的儀器，且能夠擴大生產。通過不斷改換滲析介質可除去所有的游離葯物。但是此法很費時，一般在室溫條件下，要除去95％以上的游離葯物至少需要更換三次滲析介質，時間在10～24h以上。此外，滲析介質的滲透強度應與脂質體懸液一致，否則在滲析中就會改變脂質體懸液的體積，且可能引起包裹物質的滲漏。
(三)離心法
在不同的離心力下離心是分離除去不同種類脂質體中游離葯物的有效方法。為了完全除去游離葯物，常常需重復懸浮和多次離心。使脂質體下沉所需的離心力取決於脂質體的大小，在某種程度上還取決於混懸液的絮凝狀態。如果脂質體小且分布窄，就需要高速離心及冰凍條件。低速(2000～4000r／min)離心只能使大脂質體沉降。
顯然，對於大量脂質體利用高速冰凍離心是極其耗能和昂貴的，因此此法不適於分離小脂質體。對於比較大的脂質體，低速離心可縮短操作時間並且可同時將較稀的脂質體懸液濃縮到所需濃度。為了避免脂質體遭到破壞，必須注意保證重復混懸介質的滲透壓與脂質體懸液的滲透壓相一致。
二、脂質體包封率的測定
(一)百分包封率的測定
顯然，在考查包裹物質在生物體內的行為之前必須測定該物質在脂質體中的量，採用上述方法分離除去未包入脂質體中的游離物質，就可利用下式計算出百分包封率(Encapsulation percentage。EN％)
EN％=(1一Cf／Ct)×100％
式中，Cf為游離葯物的量；Ct為脂質體懸液中葯物的總量。
這里再介紹兩種快速、用量少且適應性廣的分離游離物質並測定EN％的方法。
1．微型柱離心法(minicolumn centrifugation method)
取一塑料注射針筒，填上過濾膜作襯片，裝入用生理鹽水溶脹的Sephadex G-50，再將針筒置一離心管中低速離心(2000r／min，3min)除去多餘的生理鹽水，此時，凝膠柱變干並可能與針筒內壁分離，精確定量加入脂質體樣品，注意勿滴入柱床邊緣，離心(2000r／min，3min)使脂質體進入離心管中，待測。再在凝膠柱上加入少量生理鹽水，依上法離心，此次離心液中可能不再有脂質體或仍含有少量，這主要取決於脂質體的大小及組成，但游離葯物在此過程中因葡聚糖吸附而不會被離出，然後可在凝膠柱上再加生理鹽水，離心使柱干，此時游離葯物被洗脫進入離心液中，反復幾次，直至全部游離葯物均從柱子上離心洗脫下來，分別測定包封葯物及游離葯物濃度，就可計算出EN％(圖20—10)。
微型柱離心法的優點是脂質體懸液幾乎沒有被稀釋，對於實驗室小規模的試驗，可較好地用來分離除去未包裹葯物和快速地測定包封率。
2．魚精蛋白凝聚法(protamine aggregation)
此法可用於任何組成的脂質體，如中性或帶負電荷的脂質體(圖20－11)。方法如下：
取0.1ml脂質體懸液於10ml錐形離心管中，加入0.1ml魚精蛋白溶液(10mg／ml)，攪勻，靜置3min，再加3ml生理鹽水，在室溫條件下離心，吸取2ml上清液，測定游離葯物的濃度。將剩餘上清液棄去，沉澱物以0.6ml 10％ Triton X-100重新混懸，使脂質體膜材溶解，再補充生理鹽水至總體積為3.2ml，測定包封葯物的濃度，就可方便地算出EN％。
(二)包裹容積的測定
包裹容積(entrapped volume)是指製成的脂質體相對於每毫克磷脂所佔的內水相的體積，一般以微升(µl)表示。包裹容積的計算可通過測定包裹在脂質體內葯物的總量來推測。假設在脂質體內水性介質中葯物的濃度與開始制備時所用的葯物濃度一樣，經分離除去未包裹葯物後沒有物質從脂質體中滲漏出來，則很容易計算。但是在許多情況下，這樣的假設往往不能成立。例如用二次乳化法制備脂質體時，在乾燥除去有機溶劑時內水相可能也會失去；另外由於內外滲透壓的差異，水分子可以進入或逸出脂質體，因此測定內部容積最好的辦法是直接測定水的量。例如利用具有光譜性的液體代替內相介質，利用核磁共振法(NMR)測定，然後測出水的量。將脂質體在高速離心(200000g，6h)下沉降成為緊密的沉澱，小心除盡上清液，將沉澱物以D20(deuterium oxide)重新混懸，由於膜對於水的滲透性使整個體系中H20和D20很快達到平衡，取出少量用於磷脂量測定，剩餘部分可作水的NMR掃描，峰高與D20中含水濃度成正比，與標准溶液對照即可求得水的量，從而計算出脂質體的包裹容積。
三、脂質體的穩定性
脂質體在放置過程中可能發生多種不同的變化。如磷脂質會氧化和水解，生成短鏈的磷脂，並在膜中形成具溶解性的衍生物；另外脂質體還可發生凝聚、融合等物理變化，從而導致包裹物質的滲漏。因此脂質體制劑若要發展為產品應市，必須在貯藏期間具有良好的穩定性；在體內到達靶組織之前或發揮其緩釋作用之前亦須保持一定的大小及完整性。已證明脂質體在血液中比較穩定，但隨磷脂的化學性質、膽固醇的比例和脂質體的大小、雙分子層的數目等的不同，脂質體在體內的穩定性也會有所不同。但若在貯存過程中，葯物從脂質體迅速滲漏，則必將限制脂質體的應用價值。
(一)化學穩定性
脂質體組分磷脂的氧化降解應在制備時即加以防止，可採用一些措施盡可能地降低氧化程度，例如，使用新鮮提純的磷脂和新鮮蒸餾的溶劑，盡量避免高溫，並在充氮和無氧的條件下完成制備過程，最後將脂質體貯存於惰性環境等。
在膜材組成中加入抗氧劑也是一種有效的方法。目前常用的抗氧劑是α-生育酚，為一種無毒的食用脂質。據認為蛋卵磷脂的氧化分解可因α-生育酚的加入大大減緩。另一可選擇的降低氧化程度的方法是使用飽和磷脂代替不飽和磷脂，在天然來源的磷脂中，其不飽和度隨植物、蛋黃、哺乳動物依次增加，對於蛋黃磷脂，不飽和度取決於動物的飼料及所用的提純方法。
但是，無論是不飽和還是飽和磷脂，在脂質體的水性懸液中，都可能水解而形成溶血磷脂和脂肪酸，溶血磷脂進一步水解而形成甘油磷脂和脂肪酸，甘油和磷酸之間的酯鍵很難水解，所以不產生游離的磷酸和甘油。精製天然豆磷脂在脂質體水性懸液中的水解動力學已有研究。結果表明，豆磷脂的水解主要受H+和OH+的催化作用，在pH6.5左右水解速率最小。體系中加入緩沖離子如醋酸、枸櫞酸和緩血酸銨也可輕度增加豆磷脂的水解。
(二)物理穩定性
脂質體中包裹葯物的滲漏和凝聚、融合成大的團塊等物理穩定性問題是脂質體研究工作中的一大難題。一些研究表明，小單層脂質體在貯存中體積增大，葯物滲漏與脂質成分及包裹葯物的性質有關。由中性磷脂制備的脂質體的凝聚主要是由於范德華力相互作用所致，可在膜材中加入少量負電荷磷脂(如10％PA或PG)來克服。在膜材中加入微量的1,3-二乙醯-2-磷脂醯膽鹼也可以阻止較小脂質體的融合。
較大的脂質體在制備方法適當的條件下一般不發生融合，而小於40nm的小單層脂質體由於膜的曲率大，易於發生融合，特別在相變溫度時更易發生。
採用前體脂質體等重建脂質體的方法可以較好地避免脂質體在貯存中發生的化學和物理變化。重建脂質體有以下三種類型：含葯或不含葯的干脂質膜；含葯或不含葯的凍干脂質混合物：含葯凍干脂質體。對於干脂質膜或凍干脂質混合物，重建時所獲得的葯物包封率是有限的，特別是對親水性葯物的包封率常常不高，懸液中含有較多的游離葯物，實際應成價值不大。對於具有適當結構的親脂性葯物，重建產品可達到較滿意的包封率，但在重建過程中所需的條件，例如攪拌程度和方法，要求在高出常溫下超聲處理等，實際應用不甚方便。
對於親水性葯物，可選擇含葯凍干脂質體這一重建形式，有報道在冰凍過程中若加入親水性聚合物，如葡聚糖能產生自由流動能，利於凍干脂質體在水性介質中重建。例如當含有胰島素的凍干脂質體用這種方法處理時，其重建後的包封率可達原來的70％，即在冰凍和重建過程中胰島素的滲漏率大約為30％。如果包裹的是低分子量葯物，滲漏率可能更高些。但是，這種技術為保證脂質體制劑在貯存中的穩定性提供了一個有效的方法。
四、脂質體大小的測定
脂質體的大小將影響脂質體在體內的處置，也是脂質體重要的質量指標之一。測定脂質體大小的方法有激光掃描法，電子顯微鏡法或庫爾特粒度分析法。無疑，電鏡測定法最為准確。因為人們可以直接觀察每一個脂質體，並獲得各個大小范圍內脂質體外形的精確信息。但是要觀察大量脂質體樣本非常費時。相反．激光掃描法非常簡單且操作快速，但僅能測出脂質體的平均性質。與之類似，採用庫爾特粒度分析儀也可測出脂質體的大小分布，但後二種方法均難以描述更精細的結構。關於粒度測定的細節可參見本書第十二章。
五、脂質體的成分分析
(一)磷脂質的分析
1．含量測定
直接精確測定磷脂質濃度比較困難，因為乾燥磷脂中總含有一定量的殘留溶劑或其它雜質磷脂，因此最廣泛使用的測定磷脂的方法是非直接法，例如含磷量的測定。對於制備脂質體的大多數磷脂而言，每摩爾磷脂均含1mol磷，僅有個別例外，如每摩爾心磷脂含有2mol磷。因此樣品中磷脂的濃度可通過測定磷含量來計算。這里介紹二種磷測定法。
(1)Bartlett法
將磷脂的有機磷酸解成無機磷後，加入鉬酸銨使之轉化成磷鉬酸，磷鉬酸可用萘磺酸銨定量還原為藍色，藍色的強度由分光光度法測定，與標准品(如磷酸二氫鉀)對照即可計算出含磷量。該法靈敏度較高且重現性好，但若樣品中含有少量無機磷則會干擾測定。
(2)Stewart法
當脂質體混懸於磷酸鹽緩沖液中，此時宜採用Stewart法。該法是利用磷脂在有機溶劑中與亞鐵硫氰酸銨形成有色復合物，而不受無機磷存在的影響進行測定。在計算時，使用一與磷脂結構有關的轉換因子將吸收值換算成磷脂毫克數，該因子隨磷脂頭基不同而異。也可利用磷脂標准液繪制標准曲線來計算。因此該法不適於測定含有未知磷脂的混合物。特別須指出的是，該法不能用於甘油磷脂的測定，若脂質體中含有卵磷脂和甘油磷脂，則可用該法對前者定量，再通過Bartlett法測定總的磷脂，就可計算出甘油磷脂的量。
2．磷脂質的薄層層析
薄層層析是檢查磷脂質純度的主要手段。與所有的層析法一樣，磷脂質的薄層層析也是利用磷脂在液態有機相中對親水性固定相有不同的親和性，當液相在固定相展開時，不同的磷脂具有不同的保留時間，可根據親水性的強弱改變展開劑的組成，從而改變磷脂在兩相中的分配系數。最常用的固定相是硅膠，展開劑則常用含有氯仿的溶劑。如①氯仿：甲醇：水：(65：25：4 V／V)；②氯仿：甲醇：水：氨水(65：35：2.5：2.5 V／V)；③氯仿：丙酮：甲醇：醋酸：水(6：8：2：2：1 V／V)；④乙酸乙酯：環己烷(1：1 V／V)等。最常用的顯色劑為碘，也可用50％的硫酸 - 甲醇液或重鉻酸鉀液顯色。
(三)磷脂氧化程度
1．磷脂的氧化
磷脂脂肪酸的氧化主要是由於游離基的作用。在電磁波輻射或者微量游離金屬離子的催化下。脂肪酸碳鏈上首先脫去一個氫原子形成游離基，進而與空氣中的氧發生連鎖反應。含有雙鍵的碳鏈更易受影響，因此聚合不飽和磷脂特別容易氧化降解。在含有單個或多個不飽和脂肪酸的脂質混合物中，磷脂的氧化分成三個階段進行：①單個雙鍵的偶合；②過氧化物的形成；③形成乙醛及鏈斷裂。
值得注意的是，在無氧情況下仍會發生游離基反應導致雙重或三重偶合的形成，但不產生過氧化物。另外，降解的最後一步過程要消耗偶合雙鍵，因此在最終降解產物增加的同時，笫一步的降解產物將會減少。故很難用一種試驗方法評估磷脂的氧化程度，甚至即使應用幾個不同試驗仍僅能大致估計氧化過程相對速率大小。
2．氧化指數的測定
氧化指數是用來檢測游離基偶合的指標，因為氧化偶合後的磷脂在230nm左右具有紫外吸收峰而有別於未氧化磷脂。典型的紫外吸收圖譜如圖20－12。
國內有人提出作為制備脂質體膜材的卵磷脂，其氧化指數應控制在0.2以下，測定方法是，將磷脂溶於無水乙醇，配成一定濃度的澄明溶液，分別測定在波長233nm及215nm吸收值。按下式計算：
氧化指數 = A233nm／A215nm
3．過氧化物的測定
卵磷脂氧化產生丙二醛及溶血磷脂等。丙二醛(MDA)在酸性條件下可與硫巴比妥酸(TBA)反應，生成一種紅色染料(TBA-Pigment)
該化合物在波長535nm處有特異吸收，吸收值的大小即反映磷脂的氧化程度。有人對丙二醛量與溶血之間的關系進行了研究，實驗證明，當每毫升含卵磷脂的生理鹽水中丙二醛含量超過2.3µg時，在37℃放置1～2h即產生溶血。
除上述方法可估計磷脂的氧化程度外，根據聚合不飽和脂肪酸鏈在氧化最後階段發生斷裂或縮短，也可用氣 - 液色譜法了解這些醯基鏈的變化。
(四)膽固醇的分析
與磷脂質類似，膽固醇的純度及其氧化產物可用氣 - 液色譜法進行檢測。另外，由於膽固醇不論是游離型還是酯化型都能與含高氯酸鐵的乙酸乙酯和硫酸試劑反應生成鐵復合物，在波長610nm處有紫外吸收，採用標准膽固醇溶液對照，就可計算出膽固醇的量。
六、脂質體的滅菌
許多研究論文都認為脂質體不宜用加熱滅菌的辦法，且對各類輻射及各種化學滅菌劑也敏感，所以只能使用過濾滅菌或採用無菌操作法進行制備。這也是影響脂質體廣泛應用於臨床的一個重要原因。
近年來，國內有人採用100℃ 30min濕熱滅菌法獲得成功，滅菌前後脂質體的形態及大小均無明顯的變化，滲漏率約為5％。另有人採用輻射滅菌法，即用60鈷發出的γ射線，對三磷酸腺苷脂質體和甲氨蝶呤脂質體作輻射滅菌，照射劑量為15～20kGy，無菌試驗結果均由試驗前的陽性轉為陰性。脂質體粒徑滅菌前後無顯著變化。滅菌所致滲漏率較小。
滅菌方法的實用性可能與混懸介質種類、磷脂組成及純度等有關。採用121℃加熱20min滅菌處理幾種脂質體，發現在生理鹽水中脂質體發生凝聚，而在等滲糖溶液和多羥基化合物溶液中不發生凝聚。加熱滅菌後，具有較高的過氧化物值的含蛋卵磷脂的分散液稍變黃，改用具低過氧化物值的蛋卵磷脂、氫化蛋卵磷脂或DPPC則無此變化。在中性pH時充入氮氣也可阻止顏色變化，但加入α-生育酚無效。經0.4µm膜過濾的由蛋卵磷脂組成的脂質體的大小變小。在這一變化中，介質的類型也有明顯影響。加熱滅菌期間，包裹有羧基熒光素陰離子的負電荷脂質體(PC／chol／PG)發生滲漏，而使用正電荷脂質體(PC／chol／十八胺)不僅在加熱滅菌期間不發生滲漏，且可貯存很長時間不滲漏。
㈢ 制備脂質體為什麼要用pbs不直接用去離子水
、脂質體離
適化結構親脂性葯物鑲嵌雙層膜內包裹脂質體其包封率取決於所用脂質濃度種情況包封率達90％定要除未包裹葯物水溶性葯物言包裹葯物僅總量部必須脂質體懸液除未包裹葯物由於脂質體比包裹葯物要利用同離除未包裹葯物些凝膠濾柱層析滲析等；若包裹物質蛋白質或DNA或者未包裹葯物能形較聚結物則利用與脂質體浮力、密度同採用諸離等進行離
()柱層析
凝膠滲透層析技術廣泛用於脂質體懸液離除未包裹葯物用於懸液脂質體組技術實驗室效且快速規模產雖用凝膠濾純化技術較困難且價格昂貴另外脂質體洗脫介質稀釋能需要增加濃縮步驟
柱層析填料用葡聚糖Sephadex G-50其步驟與規致必須指：①葡聚糖表面存著能與脂質體膜結合並相互作用微部位雖種作用並影響脂質體凝膠柱流特徵仍導致少量脂質損失使膜穩定性增加導致膜滲透性改變及包裹物質滲漏種現象脂質濃度較低情況特別應予注意般通加脂質體品柱量或用空脂質體預先柱飽解決通使用20mg脂質制單層脂質體飽10g凝膠；②若凝膠顆粒太細較脂質體能滯留凝膠柱層脂質體宜選用粗級凝膠(粒徑50～150μm)單層脂質體則用任何級別凝膠
(二)滲析
簡單用除未包裹葯物(化合物除外)需要復雜技術須昂貴儀器且能夠擴產通斷改換滲析介質除所游離葯物費般室溫條件要除95％游離葯物至少需要更換三滲析介質間10～24h外滲析介質滲透強度應與脂質體懸液致否則滲析改變脂質體懸液體積且能引起包裹物質滲漏
(三)離
同離力離離除同種類脂質體游離葯物效完全除游離葯物需重復懸浮離使脂質體沉所需離力取決於脂質體某種程度取決於混懸液絮凝狀態脂質體且布窄需要高速離及冰凍條件低速(2000～4000r／min)離能使脂質體沉降
顯於量脂質體利用高速冰凍離極其耗能昂貴適於離脂質體於比較脂質體低速離縮短操作間並且同較稀脂質體懸液濃縮所需濃度避免脂質體遭破壞必須注意保證重復混懸介質滲透壓與脂質體懸液滲透壓相致
二、脂質體包封率測定
()百包封率測定
顯考查包裹物質物體內行前必須測定該物質脂質體量採用述離除未包入脂質體游離物質利用式計算百包封率(Encapsulation percentageEN％)
EN％=(1Cf／Ct)×100％
式Cf游離葯物量；Ct脂質體懸液葯物總量
再介紹兩種快速、用量少且適應性廣離游離物質並測定EN％
1．微型柱離(minicolumn centrifugation method)
取塑料注射針筒填濾膜作襯片裝入用理鹽水溶脹Sephadex G-50再針筒置離管低速離(2000r／min3min)除余理鹽水凝膠柱變干並能與針筒內壁離精確定量加入脂質體品注意勿滴入柱床邊緣離(2000r／min3min)使脂質體進入離管待測再凝膠柱加入少量理鹽水依離離液能再脂質體或仍含少量主要取決於脂質體及組游離葯物程葡聚糖吸附離凝膠柱再加理鹽水離使柱干游離葯物洗脫進入離液反復幾直至全部游離葯物均柱離洗脫別測定包封葯物及游離葯物濃度計算EN％(圖20—10)
微型柱離優點脂質體懸液幾乎沒稀釋於實驗室規模試驗較用離除未包裹葯物快速測定包封率
2．魚精蛋白凝聚(protamine aggregation)
用於任何組脂質體性或帶負電荷脂質體(圖20－11)：
取0.1ml脂質體懸液於10ml錐形離管加入0.1ml魚精蛋白溶液(10mg／ml)攪勻靜置3min再加3ml理鹽水室溫條件離吸取2ml清液測定游離葯物濃度剩餘清液棄沉澱物0.6ml 10％ Triton X-100重新混懸使脂質體膜材溶解再補充理鹽水至總體積3.2ml測定包封葯物濃度便算EN％
(二)包裹容積測定
包裹容積(entrapped volume)指制脂質體相於每毫克磷脂所佔內水相體積般微升(μl)表示包裹容積計算通測定包裹脂質體內葯物總量推測假設脂質體內水性介質葯物濃度與始制備所用葯物濃度經離除未包裹葯物沒物質脂質體滲漏則容易計算許情況假設往往能立例用二乳化制備脂質體乾燥除機溶劑內水相能失；另外由於內外滲透壓差異水進入或逸脂質體測定內部容積辦直接測定水量例利用具光譜性液體代替內相介質利用核磁共振(NMR)測定測水量脂質體高速離(200000g6h)沉降緊密沉澱除盡清液沉澱物D20(deuterium oxide)重新混懸由於膜於水滲透性使整體系H20D20快達平衡取少量用於磷脂量測定剩餘部作水NMR掃描峰高與D20含水濃度比與標准溶液照即求水量計算脂質體包裹容積
三、脂質體穩定性
脂質體放置程能發種同變化磷脂質氧化水解短鏈磷脂並膜形具溶解性衍物；另外脂質體發凝聚、融合等物理變化導致包裹物質滲漏脂質體制劑若要發展產品應市必須貯藏期間具良穩定性；體內達靶組織前或發揮其緩釋作用前亦須保持定及完整性已證明脂質體血液比較穩定隨磷脂化性質、膽固醇比例脂質體、雙層數目等同脂質體體內穩定性所同若貯存程葯物脂質體迅速滲漏則必限制脂質體應用價值
()化穩定性
脂質體組磷脂氧化降解應制備即加防止採用些措施盡能降低氧化程度例使用新鮮提純磷脂新鮮蒸餾溶劑盡量避免高溫並充氮氧條件完制備程脂質體貯存於惰性環境等
膜材組加入抗氧劑種效目前用抗氧劑α-育酚種毒食用脂質據認蛋卵磷脂氧化解α-育酚加入減緩另選擇降低氧化程度使用飽磷脂代替飽磷脂源磷脂其飽度隨植物、蛋黃、哺乳物依增加於蛋黃磷脂飽度取決於物飼料及所用提純
論飽飽磷脂脂質體水性懸液都能水解形溶血磷脂脂肪酸溶血磷脂進步水解形甘油磷脂脂肪酸甘油磷酸間酯鍵難水解所產游離磷酸甘油精製豆磷脂脂質體水性懸液水解力已研究結表明豆磷脂水解主要受H+OH+催化作用pH6.5左右水解速率體系加入緩沖離醋酸、枸櫞酸緩血酸銨輕度增加豆磷脂水解
(二)物理穩定性
脂質體包裹葯物滲漏凝聚、融合團塊等物理穩定性問題脂質體研究工作難題些研究表明單層脂質體貯存體積增葯物滲漏與脂質及包裹葯物性質關由性磷脂制備脂質體凝聚主要由於范德華力相互作用所致膜材加入少量負電荷磷脂(10％PA或PG)克服膜材加入微量1,3-二乙醯-2-磷脂醯膽鹼阻止較脂質體融合
較脂質體制備適條件般發融合於40nm單層脂質體由於膜曲率易於發融合特別相變溫度更易發
採用前體脂質體等重建脂質體較避免脂質體貯存發化物理變化重建脂質體三種類型：含葯或含葯干脂質膜；含葯或含葯凍干脂質混合物：含葯凍干脂質體於干脂質膜或凍干脂質混合物重建所獲葯物包封率限特別親水性葯物包封率高懸液含較游離葯物實際應價值於具適結構親脂性葯物重建產品達較滿意包封率重建程所需條件例攪拌程度要求高溫超聲處理等實際應用甚便
於親水性葯物選擇含葯凍干脂質體重建形式報道冰凍程若加入親水性聚合物葡聚糖能產自由流能利於凍干脂質體水性介質重建例含胰島素凍干脂質體用種處理其重建包封率達原70％即冰凍重建程胰島素滲漏率約30％包裹低量葯物滲漏率能更高些種技術保證脂質體制劑貯存穩定性提供效
四、脂質體測定
脂質體影響脂質體體內處置脂質體重要質量指標測定脂質體激光掃描電顯微鏡或庫爾特粒度析疑電鏡測定準確直接觀察每脂質體並獲各范圍內脂質體外形精確信息要觀察量脂質體本非費相反．激光掃描非簡單且操作快速僅能測脂質體平均性質與類似採用庫爾特粒度析儀測脂質體布二種均難描述更精細結構關於粒度測定細節參見本書第十二章
五、脂質體析
()磷脂質析
1．含量測定
直接精確測定磷脂質濃度比較困難乾燥磷脂總含定量殘留溶劑或其雜質磷脂廣泛使用測定磷脂非直接例含磷量測定於制備脂質體數磷脂言每摩爾磷脂均含1mol磷僅別例外每摩爾磷脂含2mol磷品磷脂濃度通測定磷含量計算介紹二種磷測定
(1)Bartlett
磷脂機磷酸解機磷加入鉬酸銨使轉化磷鉬酸磷鉬酸用萘磺酸銨定量原藍色藍色強度由光光度測定與標准品(磷酸二氫鉀)照即計算含磷量該靈敏度較高且重現性若品含少量機磷則干擾測定
(2)Stewart
脂質體混懸於磷酸鹽緩沖液宜採用Stewart該利用磷脂機溶劑與亞鐵硫氰酸銨形色復合物受機磷存影響進行測定計算使用與磷脂結構關轉換吸收值換算磷脂毫克數該隨磷脂基同異利用磷脂標准液繪制標准曲線計算該適於測定含未知磷脂混合物特別須指該能用於甘油磷脂測定若脂質體含卵磷脂甘油磷脂則用該前者定量再通Bartlett測定總磷脂計算甘油磷脂量
2．磷脂質薄層層析
薄層層析檢查磷脂質純度主要手段與所層析磷脂質薄層層析利用磷脂液態機相親水性固定相同親性液相固定相展同磷脂具同保留間根據親水性強弱改變展劑組改變磷脂兩相配系數用固定相硅膠展劑則用含氯仿溶劑①氯仿：甲醇：水：(65：25：4 V／V)；②氯仿：甲醇：水：氨水(65：35：2.5：2.5 V／V)；③氯仿：丙酮：甲醇：醋酸：水(6：8：2：2：1 V／V)；④乙酸乙酯：環烷(1：1 V／V)等用顯色劑碘用50％硫酸 - 甲醇液或重鉻酸鉀液顯色
(三)磷脂氧化程度
1．磷脂氧化
磷脂脂肪酸氧化主要由於游離基作用電磁波輻射或者微量游離金屬離催化脂肪酸碳鏈首先脫氫原形游離基進與空氣氧發連鎖反應含雙鍵碳鏈更易受影響聚合飽磷脂特別容易氧化降解含單或飽脂肪酸脂質混合物磷脂氧化三階段進行：①單雙鍵偶合；②氧化物形；③形乙醛及鏈斷裂
值注意氧情況仍發游離基反應導致雙重或三重偶合形產氧化物另外降解步程要消耗偶合雙鍵終降解產物增加同笫步降解產物減少故難用種試驗評估磷脂氧化程度甚至即使應用幾同試驗仍僅能致估計氧化程相速率
2．氧化指數測定
氧化指數用檢測游離基偶合指標氧化偶合磷脂230nm左右具紫外吸收峰別於未氧化磷脂典型紫外吸收圖譜圖20－12
內提作制備脂質體膜材卵磷脂其氧化指數應控制0.2測定磷脂溶於水乙醇配定濃度澄明溶液別測定波233nm及215nm吸收值按式計算：
氧化指數 = A233nm／A215nm
3．氧化物測定
卵磷脂氧化產丙二醛及溶血磷脂等丙二醛(MDA)酸性條件與硫巴比妥酸(TBA)反應種紅色染料(TBA-Pigment)
該化合物波535nm處特異吸收吸收值即反映磷脂氧化程度丙二醛量與溶血間關系進行研究實驗證明每毫升含卵磷脂理鹽水丙二醛含量超2.3μg37℃放置1～2h即產溶血
除述估計磷脂氧化程度外根據聚合飽脂肪酸鏈氧化階段發斷裂或縮短用氣 - 液色譜解些醯基鏈變化
(四)膽固醇析
與磷脂質類似膽固醇純度及其氧化產物用氣 - 液色譜進行檢測另外由於膽固醇論游離型酯化型都能與含高氯酸鐵乙酸乙酯硫酸試劑反應鐵復合物波610nm處紫外吸收採用標准膽固醇溶液照計算膽固醇量
六、脂質體滅菌
許研究論文都認脂質體宜用加熱滅菌辦且各類輻射及各種化滅菌劑敏所能使用濾滅菌或採用菌操作進行制備影響脂質體廣泛應用於臨床重要原
近內採用100℃ 30min濕熱滅菌獲功滅菌前脂質體形態及均明顯變化滲漏率約5％另採用輻射滅菌即用60鈷發γ射線三磷酸腺苷脂質體甲氨蝶呤脂質體作輻射滅菌照射劑量15～20kGy菌試驗結均由試驗前陽性轉陰性脂質體粒徑滅菌前顯著變化滅菌所致滲漏率較
滅菌實用性能與混懸介質種類、磷脂組及純度等關採用121℃加熱20min滅菌處理幾種脂質體發現理鹽水脂質體發凝聚等滲糖溶液羥基化合物溶液發凝聚加熱滅菌具較高氧化物值含蛋卵磷脂散液稍變黃改用具低氧化物值蛋卵磷脂、氫化蛋卵磷脂或DPPC則變化性pH充入氮氣阻止顏色變化加入α-育酚效經0.4μm膜濾由蛋卵磷脂組脂質體變變化介質類型明顯影響加熱滅菌期間包裹羧基熒光素陰離負電荷脂質體(PC／chol／PG)發滲漏使用電荷脂質體(PC／chol／十八胺)僅加熱滅菌期間發滲漏且貯存間滲漏
感覺這樣的提問是沒有意義的
還是自己找下資料吧
㈣ 脂質體濃縮方法
乙醇注入超聲法。脂質體濃縮方法是乙醇注入超聲法，既提高了產品的得率和純度，又符合工業化生產對原料、溶劑使用、製作路線、生產過程安全性等諸多方面的要求，脂質體是一種人工膜。
㈤ 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼
1.根據分子大小不同進行分離純化 蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]. 2.根據溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等. 等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最 低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]. 蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]. 有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]. 萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]. 反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑 在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋 白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質. 3.根據電荷不同進行分離純化 根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類. 在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這 種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大. 離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]. 4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.
㈥ 膜蛋白核蛋白,糖蛋白,脂蛋白異同點,及這些蛋白的分離方法和分離原理 需要詳細的答案，謝謝各位大神
膜蛋白：http://ke..com/view/145802.htm
核蛋白：http://ke..com/view/264309.htm
糖蛋白：http://ke..com/view/184084.htm
脂蛋白：http://ke..com/view/133314.htm
異同點：化學本質都是蛋白質，只不過糖蛋白有糖側鏈而已，所在位置不同，發揮的作用也不相同。
蛋白質的分離方法及原理：
根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。