甲醯胺去離子

① 去離子甲醯胺的一些嘗試性問題！！

甲醯胺不穩定，是因為受熱分解為氨和和一氧化碳！事實上甲酸，甲酸鹽，甲（酸專）醯胺都不穩定屬，受熱脫水生成CO。我想去離子甲醯胺並不是脫水形成的，因為脫水後就完全分解了！況且甲醯胺就這一種脫水分解的途徑！去離子甲醯胺其實就是很純的甲醯胺HCONH2！你可以看看這個http://www.biocity.biz/Catalog/Reagent/Sigma/200511/425.html

② 核酸雜交液中的甲醯胺是那種呢單純的甲醯胺還是去離子甲醯胺，還是別的甲醯胺，謝謝

核酸雜交液中的甲醯胺一般用去離子甲醯胺。

③ DNA和RNA提取原理是什麼還有相關試劑盒的原理，各步的作用~~

TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質．TRIzol使樣品勻漿化，細胞裂解，溶解細胞內含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心後，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉澱可回收RNA；用乙醇沉澱中間層可回收DNA；用異丙醇沉澱有機相可回收蛋白質。
TRIzol試劑可用於小量樣品（50-100mg組織、5×106細胞）也適用於大量樣品（≥1g組織、>107細胞）。對人，動物，植物組織，細菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內即可完成。分離的總RNA無蛋白質和DNA污染，可用於Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護分析和分子克隆。在用於RT-PCR時如果兩條引物存在於一個單一外顯子內，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現假陽性。共純化的DNA可用作標准，比較不同樣品RNA的得率，也可用於PCR和酶切。蛋白質可用於Western Blotting。

預防RNase污染注意事項：
1． 經常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，黴菌可能成為RNase的來源。
2． 使用滅過菌的RNA專用塑料製品避免交*污染。
3． RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取後繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料製品可在0.5M NaOH中浸泡10分鍾，然後用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。
4． 配製溶液應使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌。註：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取
准備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配製)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鍾。
6. 2-8℃10000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。
8. 2-8℃10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。
10.室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，大約晾5-10分鍾即可.不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鍾使RNA溶解.如RNA用於酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲醯胺溶解，-70℃保存。
注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2．勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉澱時也可使用台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細胞5-7μg 。
常見問題分析：
得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉澱未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
B．樣品勻漿時加的試劑量太少
C．勻漿樣品時未在室溫放置5分鍾
D．吸取水相時混入了有機相
E．RNA沉澱未完全溶解。
RNA降解：A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在用胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低於了3.5
DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或鹼性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉澱RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉澱出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿後離心，並加上以上操作步驟。

DNA的分離
准備試劑：乙醇 0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步驟:
1. 樣品加氯仿分層後,移去上層水相,用乙醇沉澱中間層和有機相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鍾，2-8℃不超過2000×g離心5分鍾。
2. 移去上清，（如需分離蛋白質，可保留，進一步操作見後）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉澱。每用1ml TRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鍾，2-8℃2000×g離心5分鍾，棄上清，重復一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉澱，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室溫放置10-20分鍾(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鍾, 棄上清。
4. 室溫放置晾乾DNA 5-15分鍾，用8mM NaOH溶解DNA。從50-70mg組織或107細胞中分離的DNA溶於300-600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉澱不易溶於水和Tris緩沖液中，建議用弱鹼溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA後可用TE，HEPES調節pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鍾除去。
DNA的定量：取一份溶於8mM NaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當於50μg/ml雙鏈DNA。根據DNA產量可估計細胞數，人，大鼠，小鼠1×106二倍體細胞含DNA的量分別為7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取DNA分別為肝和腎3-4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2-3μg 人，大鼠，小鼠培養細胞（1×106）5-7μg 成纖維細胞5-7μg
應用：1.用於PCR 溶於8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反應 用HEPES或1mM EDTA調節pH至適當值。每μg DNA使用3-5單位的酶，80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調節
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事項：
1. DNA在中間層和有機相中時可在2-8℃保存過夜。
2．DNA沉澱在75%乙醇中2-8℃可保存幾個月。
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調節pH至7-8並且加EDTA至1mM，可置於4℃或-20℃長期保存。

④ 電泳緩沖液加到什麼位置

電泳緩沖液加到一樣的位置。

電泳緩沖液的主要作用是使膠的導電性和體系的一致，這樣跑出的條帶才會一致；加樣緩沖液的主要作用是使PCR產物與其混合，使DNA沉於加樣孔的底部，防止DNA跑出來。

許多批號的試劑級甲醯胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲醯胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，並用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲醯胺分裝成小份，充氮存於-70℃。

作用

緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH。電泳時陽極與陰極都會發生電解反應，陽極發生的是氧化反應（4OH--4e->2H2O+O2)，陰極發生的是還原反應（4H++4e->2H2)，長時間的電泳將使陽極變酸，陰極變鹼。

電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利於DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。

⑤ rna電泳實驗的目的或者作用（意義）為什麼要做這個實驗

可以參考如何做RNA電泳實驗，RNA容易降解所以操作中有很多要注意的細節。。。

實驗基本原理

RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動率才與分子量成正比。

判斷RNA提取物的完整性是進行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA製品的電泳圖譜應可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶，且28s rRNA的亮度應為18s rRNA的兩倍。

實驗試劑

1、0.1%DEPC水：200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻，室溫放置過夜，高壓滅菌。

2、10x電泳緩沖液：嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0）；NaAc 0.1mol/L；乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L；

3、50mL變性瓊脂糖凝膠（1%）：10x電泳緩沖液5 mL；瓊脂糖0.5 g；0.1%DEPC水36.5 mL；加熱溶解，稍冷卻，加入8.5 ml 37%甲醛。

4、上樣緩沖液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4% 溴酚蘭，0.4%二甲苯藍。

5、甲醯胺（去離子）。

操作步驟

1、將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾乾備用。

2、制膠：稱取0.5g瓊脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻後加入5ml的10x電泳緩沖液、8.5ml的甲醛。然後在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固後使用。

3、加樣：在一個潔凈的小離心管中混合以下試劑：電泳緩沖液（10x）2μl、甲醛3.5ml、甲醯胺10ml、RNA樣品3.5μl。混勻，置60℃保溫10min，冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻，取適量加樣於凝膠點樣孔內。同時點RNA標准樣品。

4、電泳：打開電泳儀，穩壓7.5V/cm電泳。

5、電泳結束後通過紫外透視儀觀察。

注意事項

本實驗中必須保持RNase污染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配製，用具也用DEPC水沖洗，並滅菌。

⑥ 請問有誰知道核酸引物和探針PAGE純化的步驟

第20章 細胞基因分離鑒定和原位雜交

第一節 細胞DNA、RNA的分離鑒定技術

一、培養細胞基因組DNA的提取及鑒定
人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚、氯仿抽提，經RNase處理和純化來提取DNA，可用於細胞凋亡中對所引起DNA斷裂、凝膠電泳呈現「梯形」條帶的實驗，在細胞凋亡章節中已介紹了有關DNA的提取和凝膠電泳鑒定，除此之外，提取純化的DNA還可用於分析其結構，序列限制性內切酶片斷長度多態性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉澱。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。
(3)50℃水浴2小時，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3分鍾。
12000r/min離心15分鍾（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉澱DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉澱真空乾燥10分鍾。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入Nace至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉澱用70%乙醇洗一次，真空乾燥10分鍾後溶於少量TE中，4℃貯存。
(二)DNA純度檢測及含量計算
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位於波長260nm處，蛋白質則位於280nm，分別測定後，其OD260/OD280的比值應大於1.75.低於此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大於1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位於波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8
OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀釋倍數。
DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積(mL)
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標准品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組DNA，進一步進行Southern吸印分析。
二、培養細胞總RNA的提取及鑒定
細胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA傳遞蛋白質全部遺傳信息是克隆表達功能性蛋白基因的最佳來源，是蛋白質合成的場所,有特殊意義,不同的細胞所表達某種蛋白的mRNA的種類和產量是不同的，為了提高細胞轉錄的mRNA的種類和產量，通常需加入誘導劑來對細胞進行刺激培養，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取細胞總RNA的方法，常用強烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細胞，我們在細胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細胞可導致細胞結構破壞，核蛋白二級結構破壞，可利於提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析mRNA表達量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調控和進行反義RNA研究。
變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。
水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻後去除水相，再重復處理二次即可。
所用玻璃、塑料製品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜後消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。
(一)總RNA的提取方法：
1、消化收集細胞方法同前。
2、向離心管中的細胞沉澱物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振盪混勻30秒後，立即置冰上放置15分鍾，4℃ 12000r/min離心15分鍾。
4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振盪10分鍾，4℃12000rpm離心15分鍾。
5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振盪10分鍾，再同上離心，再如此反復抽提一次後取水相，加入等體積的預冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鍾，再同上離心。
6、取沉澱用70%預冷乙醇洗兩次，乾燥10分鍾，溶於DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝,-20℃凍存。
(二)總RNA的鑒定及含量計算
1、RNA純度及含量測定
取少量提取的RNA，經紫外線掃描，吸收峰位於波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。
OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數。
2、RNA分子量大小鑒定
2.1 配液：
(1)10×MOPS電泳緩沖液配製
將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺鹼，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶於800mL經DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調整pH至7.0，加入20mL經DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾除菌，避光室溫保存。
(2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步驟：
(1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，於室溫放置30分鍾或更長時間，使膠凝固。
(2)在無菌離心管中混合下列液體。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃溫育15分鍾，水浴冷卻、離心
(3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標本作分子量標准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鍾，紫外透射儀觀察分子量大小。

第二節 核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交
本技術可用於基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離後水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,並加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化後的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用於分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和後，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：

圖20-1 Southern Blot裝置圖
(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察並照像，在膠的旁邊放一尺子。
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動：
500mL 0.2mol/L HCL 10分鍾，水洗若干次
500mL變性液中浸泡15分鍾×2
500mL中和溶液浸泡30分鍾。
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小於膠3mm。
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，並加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鍾，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鍾，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鍾，氣中乾燥。
(12)將雜交後的膜曝光於X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。
(13)X片顯影、定影，然後讀片
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨後將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
加H2O 至500mL-20℃貯存
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步驟：
(1)RNA變性電泳方法同前
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置於500mL 10×SSC中浸泡45分鍾，輕輕搖動。
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
(9)曝光於X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
2、操作步驟（如圖20-2）：

圖20-2 Western Blot裝置圖

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

第三節 細胞的原位雜交技術

原位雜交(ISH)是一種可在細胞塗片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調節、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領域得到廣泛應用。經典的原位雜交技術包括載玻片處理，組織細胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術不屬於本章專業技術，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節主要介紹培養細胞的原位雜交技術。
一、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點，探針必須變性、復性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結構傾向，限制了它的組織穿透能力。適用於基因組DNA雜交。由於原位雜交的探針將與高密度的細胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結合，因此每種探針應選擇適當的濃度。
探針的獲得常採用隨機引物延伸法的PCR合成和擴增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強啟動子多克隆位點的質粒載體來合成RMA探針，也可利用質粒菌擴增質粒，經酶切後純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標記，也可以用非同位素標記，即光敏生物標記或地高辛配基標記於脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通過隨機引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構成地高辛一配基標記的核酸探針。比探針可用抗地高辛抗體偶聯酶或熒光素通過松體結合和底物顯色或產生熒光來檢測。
這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據說明書使用即可。
二、載玻片和蓋玻片預處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細胞粘附而需處理：
1、用於檢測RNA的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鍾，再用無水乙醇洗數次使其乾燥。
(2)在下列溶液中，65℃處理2小時
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鍾，180℃烘烤2小時。
2、用於檢測DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)塗載玻片。
3、對於蓋玻片：於0.1mol/L HCL中浸泡20分鍾，用無水乙醇洗，乾燥後用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。
三、組織細胞固定
理想的細胞固定過程應該保護細胞形態，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對於RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。
1、塗片細胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細胞，於0.1%胰蛋白酶消化，收獲細胞計數，塗載玻片上。
(2)若檢測RNA，固定於4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鍾，PBS洗5分鍾，系列乙醇脫水乾燥，-20℃保存。
(3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾，浸泡在下述溶液中2×5分鍾：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鍾，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鍾，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
注意：對於DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對於地高辛檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。
四、原位雜交
原位雜交與鹽濃度、溫度、甲醯胺濃度、pH等有關，DNA復性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃最佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內復性率基本上與pH無關。最好選用溫和的鹼性條件。甲醯胺有機溶劑可降低雙鏈核酸的穩定性，可避免雜交過程中處於過高的溫度，防止高溫破壞組織。
(一)同位素標記DNA探針的原位雜交
同位素標記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結合，如35S標記探針在雜交前，用未經標記的dUTP預雜交，可減少非特異，可獲較好的細胞內定位，此外還常用3H或125I標記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成單層的細胞的蓋玻片，懸浮細胞可採用離心法，將細胞粘附到塗有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標本。
(2)將標本浸入甲醇固定5分鍾，再過3次4℃預冷的10%三氯醋酸。
(3)將細胞片標本浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥，這時培養細胞蓋玻片應該用中性樹膠固定於載玻片上，注意細胞面向上。
(4)將細胞片放置在金屬盤內，並將托盤放入43℃水浴箱中預熱。
(5)直接向固定的細胞面滴加5mL含探針雜交液，然後用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。
(6)43℃恆溫水浴箱內培養18小時，此間保持箱內高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴導致雜交緩沖液乾涸。
(7)反應結束後，將玻片置於冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。
(8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片並用膠帶封閉濕盒。然後，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鍾。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鍾。
(10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥。
(11)將乾燥後的乾燥標本浸入新配製的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多餘膠，室溫乾燥5小時（在暗室中進行）。
(12)用黑紙包裹標本放在4℃冰箱曝光（3H標記的探針通常需2～4周，有時需長達100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常規顯影、定影、水洗。
(14)對標本進行Giemsa或HE染色、脫水、封片。
結果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數銀顆粒或拍攝顯微照片，用圖象分析儀進行灰度分析。
(二)同位素標記RNA探針的原位雜交
RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩定，能適應更多的條件。
(1)標本處理同前
(2)將RNA標記探針溶於雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強度）。
50～70%去離子甲醯胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鍾
(3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利於探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。
(4)用氯仿洗數次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鍾，室溫2×SSC洗5分鍾，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC,室溫15分鍾，室溫下用0.1×SSC洗5分鍾。
(5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠乾燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光於X光膠片24～48小時），隨後浸於液體乳劑。
(6)用HE染色。
(三)地高辛標記的DNA探針原位雜交
放射性同位素標記探針缺點是有放射損傷，易污染環境，需特殊防護和實驗條件，有半衰期受限、標記不穩定及曝光時間長。若改用生物素、乙醯氨基、熒光或地高辛標記可避免，其中以地高辛標記探針最敏感，隨機引物標記地高辛，其標記率很高，此探針用於原位雜交可獲高敏感性，好的細胞定位以及低背景。非同位標記探針還可以通過雙標記原位雜交法，同時測多條DNA序列。
(1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去離子甲醯胺
②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步驟：
①組織標本處理同前。
②將140ng/mL地高辛標記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。
③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進行變性10分鍾，雙鏈打開，42℃，在潮濕環境中雜交16小時。
④去除蓋玻片，按下列條件洗滌：
2×SSC室溫10分鍾→2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC 42℃ 20分鍾。
⑤再按以下方法處理：
1) 在緩沖液I中洗30分鍾。
2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鍾。
3) 滴加1:5000標有鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的地高辛抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鍾。
4) 在緩沖液I中洗2×20分鍾。
5) 在緩沖液II中洗60分鍾。
6) 加入下述溶液：緩沖液II
0.33mg/mL 四唑氮蘭
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 將切片浸於20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應。
⑥ 用底物顯色、復染、脫水、封片，按免疫組化常規法進行。
說明：
(1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片乾燥。
(2)應該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補序列的組織細胞標本進行雜交。陰性對照：①應用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未標記探針；③不加核酸探針進行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關質粒DNA替代探針進行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進行雜交。

⑦ 如何防止提取過程中RNA的降解

通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_RNA提取的一般步驟-O:Y+x$p#s8U4M9S所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對於多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可採用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉澱出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。(O(g;^+K)f+i&]%P實驗步驟：*l&d6s5e(q1F(g2|j,^0s破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。6D8}.Q;Y,g*X1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。"s%f,`0[1d*m!]0e2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。&X.P)i)Y;L#u/[3、沉澱RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。2@0d&z7?+i,g1@4、洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA一般使用TE。;L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化鋰法提取總RNA："u;}'I!r'^'^&l本方法用高濃度尿素變性蛋白並抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉澱RNA，其特別適合於從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。#~*S:}9`*r4Z3P試驗試劑："d$r6Q+_.I8Q1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，過濾滅菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、懸浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS】!m8Q4R,]&y:b#`7d試驗步驟：7[6?$`*};o7_Z'{1、對於大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鍾；對於少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，並轉移至Eppendof管中。&Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2、勻槳液在0－4℃放置4小時後，12000g離心30分鍾。x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉澱，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復步驟2。)y-x)S0K9y6j,e4、沉澱用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復溶後，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鍾並不時搖動混勻，4000g離心5分鍾。3d2v'i1~(~*D5、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉澱一次。真空乾燥。3};r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉澱，得RNA，分裝，於－70℃保存。0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－熱酚法6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本方法適合於病毒RNA的提取*I(i+b#r!K試驗試劑：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（終濃度50ug/ml）,J5pl6V/t7[/I2、2×緩沖液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O試驗步驟：#W3v8G1[$]5y1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鍾。-K0p/E'G0M#Q-z7n,{#d2、加入等體積65℃預熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鍾後再輕徭。w!`;W(~,E:i3^3、離心，取上清，氯仿抽提一次。,|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心(10000g,10min)。7[/w,h2d6U$k5、70％乙醇洗沉澱一次。真空乾燥。%A5Y;{(w%]3a*y,Oe)P6、RNA溶解液溶解沉澱，得RNA，分裝，於－70℃保存。植物RNA提取過程中難點的相應對策植物RNA提取過程中難點的相應對策)o5B7d/Q3_酚類化合物的干擾及對策：a9D*Z3K?7W許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時，酚類物質會釋放出來，氧化後使勻漿液變為褐色，並隨氧化程度的增加而加深，這一現象被稱為褐化效應（browningeffect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發現RNA提取的難易程度與材料中酚類物質的總量之間並無相關性，因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的「縮合鞣質」即聚合多羥基黃酮醇類物質（如原花色素類物質）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然後再將其與RNA分開。9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚類化合物被氧化的方法："v;y,a4k7n/Z1、還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質被氧化，有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉澱RNA時加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理後提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著多酚化合物中芳環羥基數量的增加而加強。原花色素類物質中含有許多芳環上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩定的復合物，使原花色素類物質不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，並可以在以後的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結合多酚的能力會迅速降低〔11〕。當原花色素類物質量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結合使用。p%N0w/t7r3、Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復合物，從而抑制了酚類物質的氧化及其與RNA的結合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質與BSA間可產生類似於抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復合物，減小了原花色素類物質與RNA結合的機會，因此提高了RNA的產量。BSA與PVPP結合使用提取效果會更好。由於BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨後的植物材料，可以有效地從雲杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質量的RNA。@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚類化合物的去除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通過Li+或Ca2+沉澱RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉澱RNA，而多酚溶解於2-丁氧乙醇中而被除去。然後用含50％2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉澱以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。5C6Y8a1SV:`2~多糖的干擾及對策：6I-b3R4~$T&O多糖的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產量的減少；而在沉澱RNA時，也產生多糖的凝膠狀沉澱，這種含有多糖的RNA沉澱難溶於水，或溶解後產生粘稠狀的溶液。由於多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用於進一步的分子生物學研究。在常規的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉澱RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發現有相當多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。7['X/e,d8x(B-p(|9C&n用低濃度乙醇沉澱多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉澱下來，而RNA仍保留於溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉澱多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉澱之後的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉澱多糖的，進一步純化了RNA樣品。!i5b5m*z9G8M4~-N/D另一個常用的方法是醋酸鉀沉澱多糖法。Bahloul等在提取雲杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉澱多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質。在提取某些植物材料的RNA時，是將上述兩種方法結合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質。Su等在去除褐藻的多糖時，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結合使用效果最佳。6c9|5q1b9[5l1s+nFang等認為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助於去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉澱RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取後的上清液稀釋，調節Na+離子濃度至80mM，然後加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉澱去除多糖。3B1h#M'{+{0U%U,K2@,v蛋白雜質的影響及對策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白質是污染RNA樣品的又一個重要因素。由於RNase和多酚氧化酶亦屬於蛋白質，因而要獲得完整的、高質量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質。常規的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質。'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白質與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大於蛋白質的溶解度，因而將大部分蛋白質沉澱下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時RNA能沉澱下來而能溶於70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質。3qe/\*I"A&@次級代謝產物的影響及對策：:N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{從植物組織中提取高質量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產生某些水溶性的次級代謝產物，這些次級代謝產物很容易與RNA結合並與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產物具體是什麼物質，所以，目前還沒有什麼特殊的方法來解決這個問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉澱法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由於植物組織特別是高等植物組織細胞內外組成成分的復雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對於其它生物材料來說要困難的多。實踐中經常會發現，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源於不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對於某一植物或其組織來說，其相應的RNA提取方法必需經過摸索和實踐才能確立。#S0a#G7L3S&A隨著植物分子生物學研究領域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎的植物材料RNA提取過程中還會出現新的難點，但隨著不斷地探索和經驗的積累，科學工作者們一定會迅速地解決這些難點，為植物分子生物學的發展鋪平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法植物RNA提取中的一些特殊方法$e*[2U(E%h'[多酚類植物的RNA提取：!j!d,]2V(R!B&o蘋果棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。這個方法是驗證過有效的,提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t實驗試劑：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH調至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.*j)s;t2@)t4W'F試驗步驟：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml離心管用液N2冷凍吼加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振盪1-2min,冰上放置5min。"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm離心15min,上清轉入新管,加氯仿異戊醇抽提一次。)H'L7d#d"y8@3、取600ul異丙醇,-20度沉澱20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm離心10min。!I.Y.\8b7A5、沉澱用70度乙醇洗。k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min。"A;y#}'F(`5}6I+N!x7、沉澱晾乾,溶於30ulDEPC水。;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^銀杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&Ai&V!H0`?6R銀杏、香機等木本裸子植物，酚類和多糖等次生物質含量較多，對RNA的分離和純化有很大幹擾，嚴重影響了提取RNA的質量和產量，給相關的分子生物學實驗的進行帶來阻礙。目前，RNA的提取方法很多，採取常規的Trizol試劑盒、SDS等方法不能提取銀杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA質量也較差，降解也十分嚴重。對其提取步驟進行改進，得到質量較高的銀杏RNA樣品。/s4i*Vk8S)x試驗試劑：!]!M(q#E7N3t;`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris，溶於60mL水中，用濃鹽酸調至Ph8.0，定容至lOOmL.用滅菌的DEPC水溶解。`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水中，攪拌溶解，用NaOH調pH至8.0，定容至100mL。;V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL,100mL水溶解即可。9i)@a'\&w+cp*g4、提取緩沖液(DEPC水處理):2%CTAB（蛋白質變性劑）.2%PVPK30（去除多酚類物質）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金屬鰲合劑）2.0MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,11.7gNaCL,定容到100mL。)o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5、亞精胺(提取時加少量)（RNA酶抑制劑）#J9g6O/h(u'd6、4%0一疏基乙醇(提取時加)（去除多酚類物質）'De,d(J.K$z!O9f7、氯仿異戊醇(24:1)（抽提蛋白質）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉澱大分子RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配法:2.9gNaCL,0.25gSDS,0.5mL1Mtris,100uL500mMEDTA,pH8.0,定容至50mL。.m5z+J3X0V&\6e7Y#R試驗准備：;_5z9}"f%q6t1、研缽和玻璃器皿用錫紙包好，200℃以上向溫烘烤2小時以上，或180*C高溫烘烤4小時。;X7n3w,W2}9M2、塑料製品(槍頭和離心管)最好用新的，並且用報紙包好，121'C高壓滅菌，滅菌40min，或連續兩次121'C高壓滅菌，每次滅菌20min，然後用烘箱烘千。;X*f+~,v7}.a3、所有溶液配製好後，加DEPC水使DEPCuJ濃度為0.1%,37℃過夜，1211C高壓滅菌40min.(其中Tris因為不能用DEPC處理，所以Tris用DEPC處理的水溶液滅菌後配製。))x&B,{%e"^&F:s0q試驗步驟："Y6U+`2C*\4X2a#r【根據文獻(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改進。】;F^+e9I#h/Q7m*A*]1、將4mL提取液加入到lOmL離心管c卜650C水域加熱。$D+?4w7\3J:w,M2、用液氮冷卻研缽，在研缽中加入少量的抗氧化劑PVP，取1g低溫冷凍的銀杏葉片，迅速置於研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨後，立即加入到預熱好的提取緩沖液中，用手搖功混勻。6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃，水域1min後冷卻至室溫。(N2@)U:S,{9M"e8f4、加入等體積(4mL)的氯仿:異戊X17(2=L:1)，混勻，10000rpm,40C，離心10min。(H6Po1y8p#?5、小心吸取上清液，加入等體積(4mL)的仿:異戊醇(24:1),混勻，10000rpm,40C,離心10min。.{#k/z5r:x:v1x6、吸取上清液，加1/4體積的IOMLiCL,混合，4℃沉澱過夜，然後10000rpm離心20min。7xP4o6z1D![8}7、用槍吸干，用500uLSSTE溶解沉澱，轉到1.5mL離心管.加等體積氯仿:異戊醇混勻，10000rpm,40C，離心10min。,H2b7C1d*[6r4c8、離心吸取取上清液，加兩倍體積的無水乙醉，-70℃沉澱至少30min，或一200C下沉澱2h。"W*c'Y1P-t5K)^,`9、12000rpm,40C,離心20min，去上請用70%的乙醇洗兩次，吹乾沉澱。1x,S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC處理的水溶解沉澱，得到RNA樣品。8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用於電泳和紫外檢測外，其餘RNA-70℃冰箱保存備用。Q0o7V.]9x,{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取法：1r)r#s3~|.q1v.w試驗試劑：'C7Z1^)J5A&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol異硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME貯存在4℃條件下備用。/a.I$E.RS%z2、RNA重懸液：2molLiCl10mmolNaAc調整終體積為250ml，pH5.2，滅菌後貯存在4℃條件下備用。2u;J1S9V8a.j試驗步驟：)O/o,L#q-D8v)U1、取新鮮植物材料0.5~1g，冷凍乾燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然後加入10mlRNA抽提掖充分混勻。7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃條件下8000rpm離心10min，將上層水相轉移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4℃條件下8000rpm離心10min。1N:K+]3R"a7`3、上清液轉移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混勻後，在4℃條件下8000rpm離心10min.）。$p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4、小心將上清液轉移至另一干凈離心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷無水乙醇，在-80℃條件下沉澱2小時。:t&M8O1O!C-w5a5、在4℃條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉澱重懸於RNA重懸液中，置於4℃條件下1小時。9b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉澱溶於適當體積的DEOC處理水中。檢測後分裝，置於-70℃條件下保存。

⑧ 求DGGE技術原理和操作步驟

1、實驗原理
變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決於DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當於此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴於DNA序列，即使一個鹼基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單鹼基的替代、移碼突變以及少於10個鹼基的缺失突變。
為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區——GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側引物的5′端加上一個30~40bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處於低熔點區而便於分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近於100%。
作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb，尤其適用於100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。
2步驟
1．PCR反應（同前）
其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。
2．PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。
3．垂直變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為4%-10%聚丙烯醯胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲醯胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲醯胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。
PCR產物加上樣緩沖液後上樣，300～400µl/孔
4．平行變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。
PCR產物加上樣緩沖液後，25μl～30μl/孔，電壓80-120V，溫度60℃，時間31～16小時。
5．染色5分鍾，凝膠成像儀分析結果。

⑨ 甲醯胺使DNA變性的原理是什麼

變性原理：尿素及復甲醯胺：它制們可與鹼基間形成氫鍵
加熱：高溫（70℃以上）可破壞鹼基間的氫鍵。

離子強度：提高溶液的離子強度，可中和DNA分子鏈上磷酸基團的負電荷，降低它們之間的排斥力，穩定DNA的結構。

極端的pH值：pH＜1時，DNA的磷酸二酯鍵會被水解；pH＞11.3時，DNA的所有氫鍵斷裂。

疏水作用：甲醇可增加鹼基的溶解度，三氟醋酸鈉可降低DNA分子的疏水作用，破壞雙螺旋結構引起變性。

尿素及甲醯胺：它們可與鹼基間形成氫鍵。

鹼基堆積：氫鍵和鹼基堆積是一致的，鹼基堆積是一種協同作用，處於中間的鹼基比兩邊的鹼基穩定.

⑩ 去離子甲醯胺和二甲基甲醯胺

只能用98%去離子甲醯胺