吐溫80會影響離子交換層析嗎

Ⅰ 離子交換層析的具體操作

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣：
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度，當A1>A2時為凹形梯度，A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。

Ⅱ 請教離子交換層析與親和層析方面的問題

親和層析是通過層析介質表面鍵合的配基與目標物質特異性吸附，然後非目標物流穿，再改變流動相是目標物質的特異性吸附消失，從而達到純化目的。凝膠層析是通過層析介質孔徑的設定，使分子量大小相差比較大的物質通過的路徑不一樣，從而達到分離效果。離子交換是通過層析介質表面的帶電荷的基團與目標之間產生吸附，通過改變鹽濃度使吸附力的大小改變，從而使不同的物質解吸的速度不一樣，達到分離的效果。離子交換又分陰離子交換和陽離子交換。一般來說以上三種，離子交換應用面最廣，親和特異性最好，體積排阻的話只能對分子量差距很明顯的物質進行分離。

Ⅲ 求蛋白質分離純化論文

蛋白質提取與制備的原理和方法

蛋白質提取與制備蛋白質種類很多，性質上的差異很大，既或是同類蛋白質，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處於不同的體系中，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。但多數分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶於水、稀鹽、稀酸或稀鹼溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶於乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可採用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質和酶。

蛋白質與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決於蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決於這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。提取蛋白質時常根據這些內外因素綜合加以利用。將細胞內蛋白質提取出來。並與其它不需要的物質分開。但動物材料中的蛋白質有些可溶性的形式存在於體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質，只需要適當的溶劑洗去可溶性的伴隨物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質，最後剩下的就是不溶性蛋白質。這些蛋白質經細胞破碎後，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑，將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用於白蛋白類蛋白質的抽提。如果抽提物的pH用適當緩沖液控制時，共穩定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶於稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin）溶液或有機溶劑來抽提。其它不溶於水的蛋白質通常用稀鹼溶液抽提。

蛋白質類別和溶解性質

白蛋白和球蛋白：溶於水及稀鹽、稀酸、稀鹼溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。

真球蛋白：一般在等電點時不溶於水，但加入少量的鹽、酸、鹼則可溶解。

擬球蛋白：溶於水，可為50%飽和度硫酸銨析出

醇溶蛋白：溶於70～80%乙醇中，不溶於水及無水乙醇

殼蛋白：在等電點不溶於水，也不溶於稀鹽酸，易溶於稀酸、稀鹼溶液

精蛋白：溶於水和稀酸，易在稀氨水中沉澱

組蛋白：溶於水和稀酸，易在稀氨水中沉澱

硬蛋白質: 不溶於水、鹽、稀酸及稀鹼

綴合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等): 此類蛋白質溶解性質隨蛋白質與非蛋白質結合部分的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶於稀酸、稀鹼及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露於外，則脂溶性占優勢，如脂肪部分被包圍於分子之中，則水溶性占優勢。

蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。近年來雖然有了不改進，但其主要原理仍不外乎兩個方面：

一是利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配於可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等；

二是將混合物置於單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於不同區域而達到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。由於蛋白質不能溶化，也不能蒸發，所能分配的物相只限於固相和液相，並在這兩相間互相交替進行分離純化。

制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質及溶解度等主要因素進行分類。按分子大小和形態分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點沉澱、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。

由於不同生物大分子結構及理化性質不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由於選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個統一標準的方法對任何蛋白質均可循用。因此實驗前應進行充分調查研究，查閱有關文獻資料，對欲分離提純物質的物理、化學及生物學性質先有一定了解，然後再著手進行實驗工作。對於一個未知結構及性質的試樣進行創造性的分離提純時，更需要經過各種方法比較和摸索，才能找到一些工作規律和獲得預期結果。其次在分離提純工作前，常須建立相應的分析鑒定方法，以正確指導整個分離純化工作的順利進行。高度提純某一生物大分子，一般要經過多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達到目的。因此，整個實驗過程方法的優劣，選擇條件效果的好壞，均須通過分析鑒定來判明。

另一方面，蛋白質常以與其他生物體物質結合形式存在，因此也易與這些物質結合，這給分離精製帶來了困難。如極微量的金屬和糖對巨大蛋白質的穩定性起決定作用，若被除去則不穩定的蛋白質結晶化的難度也隨之增加。如高峰澱粉酶A的Ca2+，胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質具有一定的立體構象，相當不穩定，如前所述極易變性、變構，因此限制了分離精製的方法。通常是根據具體對象聯用各種方法。為得到天然狀態的蛋白質，盡量採用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，並還要注意防腐。

注意共存成分的影響。如蝮蛇粗毒的蛋白質水解酶活性很高，在分離純化中需引起重視。純化蝮蛇神經毒素時，當室溫超過20℃時，幾乎得不到神經毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA完全抑制，因此在進行柱層析前先將粗毒素0.1mol/LEDTA溶液處理，即使在室溫高於20℃，仍能很好的得到神經毒素。

整個制備過程一般可分為5個階段：

①材料的選擇和預處理

②細胞的破碎（有時需進行細胞器的分離）

③提取

④純化（包括鹽析，有機溶劑沉澱，有機溶劑提取、吸附、層析、超離心及結晶等）

⑤濃縮、乾燥及保存。以上5個階段不是要求每個方案都完整地具備，也不是每一階段截然分開。

不論是哪一階段使用哪一種方法，均必須在操作中保存生物大分子結構的完整性。保存活性防止變性及降解現象的發生。因空間結構主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在，遇酸、遇鹼、高溫、劇烈的機械作用及強烈的輻射等均可導致活性喪失。因此選擇的條件應為十分溫和。同時應注意防止系統中重金屬離子、細胞自身酶系及其他有毒物質的污染。

蛋白質提取與制備的注意事宜：

一、原料的選擇

早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白質。但至目前經常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。

原料的選擇主要依據實驗目的定。從工業生產角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時這幾方面不同時具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易於獲得純品者。一般要注意種屬的關系，如鰹的心肌細胞色素C較馬的易結晶，馬的血紅蛋白 較牛的易結晶。要事前調查制備的難易情況。若利用蛋白質的活性，對原料的種屬應幾乎無影響。如利用胰蛋白 酶水解蛋白質的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質自身的性質及結構時，原料的來源種屬必須一定。研究由於病態引起的特殊蛋白質（本斯.瓊斯氏蛋白 、貧血血紅蛋白 ）時，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個體的原料。可能時盡量用全年均可採到的原料。對動物生理狀態間的差異（如飢餓時脂肪和糖類相對減少），採收期及產地等因素也要注意。

二、前處理

1、細胞的破碎

材料選定通常要進行處理。要剔除結締組織及脂肪組織。如不能立即進行實驗，則應冷凍保存。除了提取及胞細外成分，對細胞內及多細胞生物組織中的蛋白質的分離提取均須先將細胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預先絞碎再製成勻槳。

⑴機械方法

主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），宜用於動物內臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用於少量材料，也可用不銹鋼或硬質塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細胞破碎程度較高速搗碎機高，機械切力對分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當的緩沖劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。但在磨細時局部往往生熱導致變性或pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細劑的吸附也可導致損失。

⑵物理方法

主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。

Ⅰ反復凍融法

於冷藏庫或乾冰反復於零下15～20℃使之凍固，然後緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由於滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白 凍結變性。

Ⅱ冷熱變替法

將材料投入沸水中，於90℃左右維持數分鍾，立即置於冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。

Ⅲ超聲波法

暴露於9～10千周聲波或10～500千周超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。

Ⅳ加壓破碎法

加一定氣壓或水壓也可使細胞破碎。

⑶化學及生物化學方法

Ⅰ有機溶媒法

粉碎後的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為乾燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙乾燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性。

Ⅱ自溶法

將待破碎的鮮材料在一定pH和適當的溫度下，利用自身的蛋白 酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟製取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。於溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化，隨時要調節pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。

Ⅲ酶法

與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。但值得提出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內完全溶菌。於生理食鹽水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。

表面活性劑處理

較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡淀及去氧膽酸鈉等。

此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置於水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。

2、細胞器的分離

制備某一種生物大分子需要採用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎後常將細胞內各組分先行分離，對於制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來分子生物學、分子遺傳學、遺傳工程等學科和技術的發展，對分布在各種細胞器上的核酸和蛋白質的研究工作日益增多，分離各種細胞器上的各類核酸和特異性蛋白質已成為生物大分子制備工作重要內容之一。各類生物大分子在細胞內的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細胞核內。RNA則大部分分布於細胞質。各種酶在細胞內分布也有一定位置。因此制備細胞器上的生物大分子時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布匹有所了解。

以肝細胞為例,蛋白質、酶及核酸在肝細胞內分布情況為:

細胞核: 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系 RNA占總量10%左右 DNA幾乎全部

粒線體: 電子傳遞、氯化磷酸化、三羧酸循環、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶

系RNA占總量5%左右 DNA微量

內質網（微粒體）: 蛋白質合成酶系、羥化酶系 RNA占總量50%左右

溶酶體：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）

高爾基氏體: 糖苷轉移酶、粘多糖及類固醇合成酶系

細胞膜：載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP酶、環化腺苷酶、5』-核苷酸酶、琥珀酸脫

氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶等 ,細胞液 嘧啶和嘌呤代謝、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白類 RNA（主要為tRNA）占總量30%.

細胞器的分離一般採用差速離心法。細胞經過破碎後，在適當介質中進行差速離心。利用細胞各組分質量大小不同，沉降於離心管內不同區域，分離後即得所需組分。細胞器的分離制備、介質的選擇十分重要。最早使用的介質是生理鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發生聚集作用結成塊狀，沉澱分離效果不理想，現一般改用蔗糖、Ficoll（一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。

1.水溶液提取

大部分蛋白質均溶於水、稀鹽、稀鹼或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，也是提取蛋白質的最常用溶劑。以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質經常注意下面幾個因素。

鹽濃度

等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L氯化鈉溶液應用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質需用1mol/L以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶，細胞破碎後選擇適當的鹽濃度及PH，一般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊的，需採用有機溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。

PH值

蛋白質提取液的PH值首先應保證在蛋白質穩定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。如鹼性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏鹼一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。如細胞色素C屬鹼性蛋白質，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀鹼提取。某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式存在，選擇pH3～6范圍對於分離提取是有利的。

溫度

多數酶的提取溫度在5℃以下。少數對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利於提取和進一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。

此外提取酶時加入底物或輔酶，改變酶分子表面電荷分布，也能促進提取效果。

2.有機溶劑提取

有機溶劑提取用於提取蛋白質的實例至今是不多的。但一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶於水、稀鹽或稀鹼液中，可用不同比例的有機溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria）及微粒體（Microsome）等含多量脂質物質中提取蛋白質時，採用Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解10%，因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可占據蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度-2℃至40℃）。國內用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。丁醇法對提取鹼性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶於稀酸、稀鹼又能溶於酸性乙醇或酸性丙酮中。以60―70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。

3.表面活性劑的利用

對於某些與脂質結合的蛋白質和酶，也有採用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。

表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化苄烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐溫60及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對於膜結構上的脂蛋白和結構，己廣泛採用膽酸鹽處理，兩者形成復合物，並帶上凈電荷，由於電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型表面活性劑。

4.對提取物的保護

在各種細胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數蛋白水解酶的最適PH在3～5或更高些，因在較低PH條件下可降低蛋白質水解酶引起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態，不表現水解活力。加蛋白質水解酶的抑制劑也同樣起保護作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以巰基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機溶劑時也能產生相類似的作用。蛋白水解酶的性質變化很大，上述條件均視具體對象而變化。

有一些蛋白含巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA，後者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質帶一些非共價鍵結合的配基。提取時要注意保護，不要使酸基丟失。

蛋白質提取與制備的方法：

1.分離純化的原則

從破碎材料或細胞器提出的蛋白質是不純的，需進一步純化。純化包括將蛋白質與非蛋白質分開，將各種不同的蛋白質分開。選擇提取條件時，就要考慮盡量除去非蛋白質。一般總是有其它物質伴隨混入提取液中。但有些雜質（如脂肪）以事先除去為宜。先除去便於以後操作。常用有機溶劑提取除去。

對於異類物質，提純蛋白質和酶時常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶水解，有機溶劑抽取及選擇性部分沉澱等方法處理。小分子物質常在整個制備過程中通過多次液相與固相轉化中被分離或最後用透析法除去。而對同類物質如酶與雜蛋白、RNA、DNA以及不同結構的蛋白質、酶、核酸之間產分離，情況則復雜得多。主要採用的方法有鹽析法、有機溶劑沉澱法，等電點沉澱法、吸附法、結晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。其中鹽析法、等電點法及結晶法用於蛋白質和酶的提純較多，有機溶劑抽提和沉澱用於核提純較多，柱層析法、梯度離心法對蛋白質和核酸的提純應用十分廣泛。如前所述，蛋白質的分離純化較難，而且其本身的性質又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微細特徵，巧妙的聯用各種方法並進行嚴密的操作，同時有必要了解精製各過程的精製程度和回收率。具有活性的蛋白質可利用吸收光譜等物理性質或以相當於單位氮活性增加為尺度進行追蹤。其他蛋白質可用電泳、超離心、層析、擴散及溶解等測定純度。如結晶核糖核酸酶經層析分為兩個成分。可見對確定蛋白質結晶純度尚無最終的尺度。根據經驗即或純凈的標准品，有極微量的不純物時，也會給實驗帶來較大的影響。不穩定的蛋白質，如分離SH-酶時使用試劑及緩沖液等，要確認不含重金屬離子（特級試劑也需檢定）。蛋白質純化的操作如脫鹽、濃縮乾燥等均與低分子化合物不同，必須經過獨特的繁瑣操作。

蛋白質和蛋白質相互分離主要利用它們之間的各種性質的微小差別。諸如分子形狀、分子量大小、電離性質、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質提取液中，除包含所需要的蛋白質（或酶）外，還含有其它蛋白質、多糖、脂類、核酸及肽類等雜質。

雜質除去的方法有：

A.核酸沉澱法

該法可用核酸沉澱劑和氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈黴素等。必要時也可用脫氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗勻漿中加入少量DNase,於4℃保溫30～60min，可使DNA降解為足夠小的碎片，以致不影響以後的純化。

B.醋酸鉛沉澱法

利用醋酸鉛沉澱劑除去雜蛋白。因這些沉澱劑也常常使需要的酶（或蛋白質）緩緩變性而失去活性，所以用這類試劑時應迅速進行鹽析，使樣品與這類試劑脫離接觸。

C.調pH值或加熱沉澱法

利用蛋白質酸鹼變性性質的差異除去雜蛋白。利用蛋白質的熱變性的溫度系數差異，可在一定的PH下將蛋白提取液加熱到一定的溫度，使對熱不穩定的雜蛋白性沉澱而除去。

D.選擇性變性法

利用各種蛋白質穩定性的不同，可用選擇性變性法來除去雜蛋白 。例如胰蛋白 酶及細胞色素C等少數特別穩定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸處理，此時其它雜蛋白 均變性而沉澱，而胰蛋白 酶和細胞色素C則仍留在溶液中。

E.透析法

小分子物質常在整個制備過程中多次液相與固相互轉化中被分離，或最後用透析法除去。

F.利用溶解度不同的純化方法

2.鹽析法

鹽析法對於許多非電解質的分離純化均適合。對蛋白質和酶的提純應用也最早。至今還廣泛使用，一般粗抽提物經常利用鹽析法進行粗分。也有反復用鹽析法得到純的蛋白質的例子。其原理是蛋白質在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加（鹽溶，與離子強度10～1間成比例增加）。球蛋白 當鹽濃度不斷上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降並先後析出（鹽析）（離子強度I2～10）。這是由於蛋白質分子內和分子間的電荷的極性基團有靜電引力。當水中加入少量鹽時，鹽離子與水分子對蛋白質分子一的極性基團的影響，使蛋白質在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時，水的活度降低，蛋白質表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，於是蛋白質相互聚集而沉澱析出。鹽析法是根據不同蛋白質在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達到彼此分離的方法。

鹽的選擇

如上所述，蛋白質在水中溶解度取決於蛋白質分子上離子基團周圍的水分子數目，即取決於蛋白質的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白質的溶解度。控制方法最常用的是加入中性鹽。主要有硫酸銨、硫酸鎂 、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最廣的是硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25℃時飽滿和溶解度為4.1mol,即767g/l;0℃時飽滿和溶解度為3.9mol,即676g/l）。在這一溶解度范圍內，許多蛋白質均可鹽析出來，且硫酸銨價廉易得，分段效果較其它鹽好，不易引起蛋白質變性。應用硫酸銨時對蛋白 氮的測定有干擾，另外緩沖能力較差，故有時也應用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白 ，用硫酸鈉的效果也不錯，硫酸鈉的缺點是30℃以下溶解度太低。其它的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由於溶解度太低，受溫度影響大，故應用不廣。氯化鈉的溶解度不如硫酸銨，但在不同溫度下它的溶解度變化不大，這是方便之處。它也是便宜不易純化的試劑。

硫酸銨濃溶液的PH常在4.5～5.5之間,市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸,PH值往往降至4.5以下,當用其他PH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節.

確定沉澱蛋白質所需硫酸銨濃度的方法

將少量樣品冷卻到0～5℃，然後攪拌加入固體硫酸銨粉末，見蛋白質產生沉澱時，離心除去沉澱，分析上清液確定所要蛋白質的濃度，如它仍在溶液中則棄去沉澱，再加更多的硫酸銨於上清液中，直到產生蛋白質沉澱時止。以所要提取的蛋白質在溶液中的濃度對硫酸銨濃度作圖，得沉澱曲線，找出蛋白質開始沉澱的濃度。如不考慮收率，飽和度區間可取得窄一些，使純度高一些。

鹽析時注意的幾個問題:

(1)鹽的飽和度: 不同蛋白質鹽析時要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組成的蛋白質時，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現一種蛋白質沉澱進行離心或過濾分離後，再繼續增加鹽的飽和度，使第2種蛋白質沉澱。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質飽和度達20%時，纖維蛋白原首先析出；飽和增至28～33%時，優球蛋白 析出；飽和度再增至33～50%時，擬球蛋白 析出；飽和度大於50%以上時清蛋白 析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液中分離得到9種以上蛋白質及酶。

(2)PH值: pH值在等電點時蛋白質溶解度最小易沉澱析出。因此鹽析時除個別特殊情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質等電點附近。由於硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH值低於7，如所要蛋白質遇酸易變性則應在適當緩沖液中進行。

(3)蛋白質濃度: 在相同鹽析條件下蛋白質濃度愈高愈易沉澱。使用鹽的飽和度的極限也愈低。如血清球蛋白 的濃度從0.5%增至3.0%時,需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%.某一蛋白質欲進行兩次鹽析時,第1次由於濃度較稀,鹽析分段范圍較寬,第2次則逐漸變窄.例如膽鹼酯酶用硫酸銨鹽析進時，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%,第2次為40%至60%.蛋白質濃度高些雖然對沉澱有利,但濃度過高也易引起雜蛋白的共沉作用.因此,必須選擇適當濃度盡可能避免共沉作用的干擾。

(4)溫度: 由於濃鹽液對蛋白質有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行。至於某些對熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質鹽析時對溫度要求不太嚴格。但在中性鹽中結晶純化時，溫度影響則比較明顯。
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Ⅳ 離子交換層析的原理是什麼 已解決

離子交換層析法是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物內質的酸鹼性容，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。

層析開始前，功能基團與反離子穩定結合，就與反離子發生可逆交換，與層析劑結合被固定下來。因為鹽離子可以與底物競爭功能基團，鹽濃度越高樣品與層析劑結合越不緊密，易被洗脫下來。不同物質與層析劑結合程度不同，洗脫下來的時間不同，因此得以分開。

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離子交換劑的選擇首重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱，陰陽離子交換劑的選擇若被分離物質帶正電荷，這些鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑。

在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生，若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌。

Ⅳ 柱層析原理及影響因素

柱層析總的原理，就是讓目標蛋白結合在層析填料（樹脂）上，然後通過特定的緩沖液將其洗脫下來，以達到純化的效果。具體幾種分類稍微歸納了下給你參考
免疫親和層析
原理：親和色譜分離蛋白以一個蛋白與特異性配基配對到色譜基質上，且蛋白質與配基間具有可逆的相互作用作為基礎。目標蛋白與配基之間的生物學相互作用，可以是由於靜電學的相互作用或是分子間疏水的相互作用，也可以是范德華力或氫鍵結合力產生的。
影響因素：主要是親和標簽的完整程度，緩沖液的組分。
離子交換層析
原理：離子交換對分子的分離是基於它們表面凈電荷的差異。以蛋白質為例，它由許多包含弱酸弱鹼集團的不同氨基酸組成。它們表面的凈電荷會隨著周圍環境的pH值改變而改變。對某一特定蛋白質來說，其表面凈電荷與pH之間的相對關系是獨特的，而離子交換層析正是利用了這一特點來完成對不同蛋白質的分離。
影響因素：主要是緩沖液的pH值，鹽濃度。
疏水相互作用層析
原理：疏水層析根據蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白質與疏水層析介質疏表面可逆的相互作用來分離蛋白。純水狀態下，任何疏水作用都太弱而不能導致配基與蛋白之間的相互作用。某些鹽卻可以增強疏水相互作用。高濃度的鹽會增強相互作用，而低濃度的鹽會降低相互作用。但是目前尚無被廣泛接受的關於疏水相互作用層析機制的理論。
影響因素：環境溫度，鹽濃度。
凝膠過濾層析
凝膠過濾根據分子通過凝膠填料大小不同對其進行分離。以蛋白質為例，因為分子不與凝膠填料結合，故緩沖液成分不會直接影響解析度。
影響因素：蛋白質分子量。

Ⅵ 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

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對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

Ⅶ 離子交換層析法原理是什麼

離子交換層析法 （ion exchange chromatography，簡稱IEC）是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物質的酸鹼性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。
離子交換層析法大致分為5個步驟：
1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。
3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。
4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由於連續添加新的交換溶液，所以會朝正反應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，最後被洗下來。由於不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時），隨後是中性氨基酸，如glycine和alanine。鹼性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現。

Ⅷ 離子交換層析中樣品溶液中的組分離子濃度為什麼不能太高

濃度太高可能超過離子交換樹脂的交換范圍，以至樹脂上的離子交換殆盡而溶液中還有待交換的離子。另外可能在溶液流經層析柱時由於交換速率過小而不能完全交換。

Ⅸ 什麼因素可影響離子交換柱層析法分離氨基酸

柱溫；
柱長徑比；
進料量；
進料濃度；
洗脫速度；
洗脫液pH；
交換柱配體的極性強弱；
樹脂交聯度；
樹脂粒徑等因素都會有影響。

Ⅹ 交換容量的影響因素

影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應盡量能夠讓樣品組分進入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因為小分子可以自由的進入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大於大孔隙的離子交換劑。對於較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因為對於很大的分子，一般不能進入孔隙內部，交換只限於顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。本文來自:博研聯盟論壇
另一些影響因素如實驗中的離子強度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質。一般pH對弱酸和弱鹼型離子交換劑影響較大，如對於弱酸型離子交換劑在pH較高時，電荷基團充分解離，交換容量大，而在較低的pH時，電荷基團不易解離，交換容量小。同時pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對於蛋白質等兩性物質，在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結合。一般來說，離子強度增大，交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫，就是要降低交換容量以將結合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。本文來自:博研聯盟論壇