cl4b凝膠過濾

① 什麼是葡萄糖殘基

葡萄糖殘基，即糖殘基，糖類物質水解之後得到的水解基團，一般由雙糖或多糖類物質水解得到。糖苷一般由殘基（糖殘基）和配基（非糖部分）組成，糖的殘基和配基之間的鍵稱為苷鍵。多糖類物質由多個單糖殘基以糖苷鍵連接形成的多聚物，例如直鏈澱粉和支鏈澱粉等。

糖原為無定形粉末，不溶於冷水，易溶於熱水，其水溶液遇碘顯棕紅色。糖原能被α一澱粉酶水解。與支鏈澱粉類似，糖原也是由α-D-葡萄糖通過α-1，4-苷鍵和α-1，6-苷鍵連接成的多糖。糖原分支程度更高，支鏈更多、更短，每隔8～10葡萄糖殘基就有一個支鏈，相對分子質量高達1×108。

(1)cl4b凝膠過濾擴展閱讀：

糖原存在於如肝臟和骨髂肌這些組織內的微小顆粒中；這些顆粒也含有緊密結合的糖原磷酸化酶和糖原合成酶。肝糖原的葡萄糖殘基進行經常的非常快的轉換，因為大量的葡萄糖和其它己糖從小腸到達肝臟，在經過暫時地以糖原貯存後，又再以血糖的形式離開肝臟。

並非糖原的高度分支結構的所有部分都以同樣的速率轉換。大多數葡萄糖殘基的轉換發生在外周分支，而糖原的內核結構代謝較為穩定，其轉換速率很低。

② RNA反轉錄合成cDNA第一鏈後是以什麼狀態存在的

RNA反轉錄合成cDNA第一鏈後是以雙鏈的穩定形式存在的。

cDNA構建分為六個階段：

階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

cDNA 第一鏈的合成：

用親和層析法得到 mRNA 後，根據 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾結構的原理，用 12~20 個核苷酸長的 oligo （ dT ）與純化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）會與 poly (A) 結合作為反轉錄酶的引物，反轉錄反應的產物是一條 RNA-DNA 的雜交鏈。 oligo （ dT ）結合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全長的 cDNA 需要反轉錄酶從 mRNA 分子的一端移動到另一端，有時這種全合成難以達到，尤其是 mRNA 鏈很長時，為此建立了一種隨機引物法合成 cDNA 。隨機引物是一種長度為 6~10 個核苷酸，由 4 種鹼基隨機組成的 DNA 片段。與 oligo （ dT ）僅與 mRNA 3' 端結合不同，它們可以在 mRNA 的不同位點結合。隨機引物法合成的產物也是 RNA-DNA 的雜交體。把 cDNA 克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的 RNA 轉變成 DNA 鏈，即形成雙鏈DNA 分子。

③ 凝膠滲透柱層析

凝膠滲透層析就是按照溶質分子的大小不同而進行分離的一種層析技術。當溶質分子大小不同的樣品溶液通過凝膠柱時，由於凝膠顆粒內部的網路結構具有分子篩效應，分子大小不同的溶質就會受到不同的阻滯作用。分子量大的因不易滲入網路，被排阻在顆粒之外，因而所受到的阻滯作用小，1.凝膠顆粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出層析床，分子量小的因能滲透到網路圖1、凝膠滲透層析原理示意圖內部洗脫流程長，因而所受到的阻滯作用大，後流出層析床，這樣就可以達到分離的目的。

凝膠層析的關鍵在於建立液固相平衡，然後以合適的洗脫速度將不同物質分離流出。溫度高有利於快速建立液固相平衡。但是，溫度高也造成溶質在液體中會擴散太快，導致分離效率降低。
目的是分離混合物，獲得一定數量的純凈組分，這包括對有機合成產物的純化、天然產物的分離純化

④ 糖殘基是什麼

多糖類化合物
多糖類化合物是靈芝所含化學成分之一，現已證明，靈芝多糖類具有抗腫瘤作用、免疫調節作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故靈芝多糖類是靈芝的主要有效成分。臨床試驗也證實，靈芝多糖可作為腫瘤化學治療和放射治療的有效輔助治療葯。有關靈芝多糖類的分離、純化、結構確證的研究方興未艾，迄今仍為國內外矚目的重要課題。

一、靈芝多糖類的分離、純化及鑒定

靈芝多糖類的分離、純化及結構確證的方法及步驟可概括如下：多採用熱水提取、分部沉澱的方式分離靈芝的多糖組分；進一步經各種層析如DEAE纖維素柱色譜、Sephadex G75柱色譜，凝膠過濾如Sepharose CL—4B凝膠過濾，高壓電泳和聚丙醯胺凝膠電泳等處理可獲純化的多糖；後者經酸水解、紙色譜、氣相色譜分析可確定其單糖組分，經酶水解可檢測殊碳糖（anomeric）結構；經甲基化技術及Smith降解、氣相色譜、氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振等可確定多糖的連接方式和基本化學結構。多糖的分子量可通過凝膠柱色譜如SephadeaxG—100柱色譜、超離心測沉降系數等方法測定，一般在測得分子量范圍後，求出平均分子量。

二、靈芝多糖類的理化特性

由於靈芝的種類、產地、分離提取方法各異，所獲靈芝多糖的理化特性、分子量、單糖組分和連接方式不同，生物活性亦有差異。如Hiroshi等（1985）報道，赤芝子實體熱水提取物經濃縮、透析及系列色譜後獲得兩種多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者對小鼠均具降血糖作用。隨後，他們又從赤芝子實體中分離出兩個降血糖有效成分ganoderan B和C，均為糖肽，分子量分別為7 400和5 800。物理化學和化學研究證明，ganoderan B含吡喃葡萄糖醯基β-1→3主鏈和β-1→6側鏈，ganoderan C則含D-吡喃葡萄糖醯基β-1→3和β-1→6連接和D-吡喃半乳糖醯基α-1→6連接。Mizuno等（1986）報告，赤芝子實體經85%乙醇（80℃），熱水（100℃），3%草酸銨（100℃）和5%氫氧化鈉（30℃）提取後，殘渣再用5%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，80℃），20%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，30℃）和5%氯化鋰（溶於二甲醋酸銨中，70℃）提取，獲多糖組分A、B、C。A和B經乙醇分離，醋酸沉澱，Sepharose CL-4B凝膠過濾，得4個β-葡聚糖，其中I和II來自A，III和IV來自B。從C分離出脫乙醯殼多糖（chitosan）（V）。I—V經80%甲酸（85℃）處理可獲相應的甲醯化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖組成，並具β-（1→3）-D-葡聚糖主鏈和β-（1→6）葡萄糖基側鏈，其分子量分別為330 000、60 000、160 000和110 000。不同之處是IV不含木糖，但含1.2%蛋白質。V經酸水解後，主要含葡萄糖胺，並含少量葡萄糖，經紅外光譜和X射線分析證明為脫乙醯殼多糖。給小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I～IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗腫瘤活性，半數抑瘤量（ID50）分別為42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）報告，赤芝子實體經水提取後，其殘渣經3%草酸銨溶液（100℃）和5%氫氧化鈉溶液（30℃）提取後，得2個水不溶多糖A和B。A經真空濃縮、透析、凍干，Shepharose CL-48凝膠過濾，獲主要組分C。B用醋酸中和至pH5～6，得酸性異多糖D，加乙醇沉澱得糖蛋白E和另一種異多糖。C由酸性β-D-葡聚糖構成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000～30 000。D的分離程序同A，它含兩個主要成分G和H，G和H均為酸性異多糖，分別含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000～100 000。給小鼠腹腔注射A—H對S180均具有抗腫瘤活性，50%抑瘤量為（6.3～26.3)mg/kg，但口服無效。1989～1994李榮芷、何雲慶等先後報告，赤芝子實體經熱水提取，乙醇分部沉澱、透析、除蛋白等步驟得靈芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。進一步經DEAE纖維素柱色譜分離，酶解，酸水解，過碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、氣相色譜、高壓液相色譜分析和光譜分析等從BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C中共分離鑒定了18個靈芝多糖均一體，其中5個肽多糖、4個葡聚糖，其餘為雜多糖，其化學結構及分子量見表6-4。

表6-4 靈芝多糖的化學結構和分子量

均一體
化學結構

分子量

BN3B
BN3B1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
3.50×104

BN3B2
β（1→6）β（1→3）
阿拉伯半乳聚糖
4.00×104

BN3C
BN3C1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
1.62×104

BN3C2
β（1→6）β（1→3）
肽多糖
2.45×104

GLA
GLA2

肽多糖
0.93×104

GLA4
均以β（1→3）為主
雜多糖
1.33×104

GLA6
含少量β（1→6）及β（1→4）
肽多糖
1.28×104

GLA7
以半乳糖、葡萄糖為主
雜多糖
1.20×104

GLA8

肽多糖
1.48×104

GLB
GLB2
β（1→4）為主，尚有β（1→6）
葡聚糖
0.71×104

GLB3
β（1→4）為主，極少β（1→6）
甘露葡聚糖
0.77×104

GLB4
β（1→4）
雜多糖
0.90×104

GLB6
β（1→4）含乙醯基
雜多糖
0.88×104

GLB7
β（1→4）為主，尚有β（1→6）
雜多糖
0.90×104

GLB9
β（1→4）為主
半乳葡聚糖
0.93×104

GLB10
β（1→4）β（1→6）含乙醯基
雜多糖
0.68×104

GLC
GLC1
β（1→4）少量β（1→6）
肽多糖
0.57×104

GLC2
β（1→4）少量β（1→6）含乙醯基
葡聚糖
0.60×104

Mizuno等（1982）經熱水提取，乙醇分部沉澱，並經離子交換色譜，pH依賴的Cetavlon處理、凝膠過濾以及Con A-Sepharose GL-4B親和色譜等純化，從人工培養的平蓋靈芝菌絲體中得到一個多糖組分。進一步通過甲基化、核磁共振、過碘酸氧化、Smith降解和β-D-葡聚糖酶（β-D-glucanase）分解等技術研究多糖的化學結構。α-葡聚糖組分具有α（1→4）葡萄糖苷主鏈，主鏈上每9～12個殘基連接α（1→6）支鏈，該組分僅有微弱抗腫瘤活性。β-葡聚糖組分具有β（1→3）葡萄糖苷主鏈，主鏈上每12個殘基通過β（1→6）連接一個單糖苷支鏈。其中之一顯示顯著的抗小鼠S180活性，50%抑瘤劑量為0.74mg/kg。

Mizuno和Miyasaki等分別從赤芝、平蓋靈芝和紫芝加哥提取出具有抗腫瘤活性的多糖。並確證其基本化學結構。

就抗腫瘤活性而言，靈芝多糖並無種間差異，它們和從其他真菌中所獲多糖一樣，具有以下三個特性：

1.初級結構的分子量在3×105以上。

2.多聚物的連接方式均有β-1-3-D-殘基的主鏈和β-1-6-D-葡萄糖側鏈殘基。但從不同真菌提取的多糖的β-1-6-D-葡萄糖的分支程度不等，靈芝多糖的主鏈殘基與側鏈殘基的比例為5∶2，即每個主鏈殘基環繞2個β-1-6-D-葡萄糖殘基。無1-6β側鏈的1-3-β葡聚糖未見抗腫瘤活性。

3.多糖的三維螺旋結構參與其抗腫瘤活性，此結構遭破壞則影響其活性。 |

⑤ 生物實驗方法除了對照實驗以外有哪些

cDNA文庫

[原理]：

cDNA文庫不同於基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然後除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。

cDNA文庫的構建

分為六個階段：

階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

[階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈]

1．在置於冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：

poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl2 2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制劑（選用） 25單位

加H2O至 48μl

2．當所有反應組在0℃混合後，取出2.5μl反應液轉移到另一個0.5ml微量離心管內。在這個小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h。

4．溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然後將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然後轉移至冰上。

5．參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉澱的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質量參照物通過鹼性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。

6．按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：

[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

7．盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。

[階段2：cDNA第二鏈的合成]

1．將下列試劑直接加入大規模第一鏈反應混合物中：