凝膠過濾層析需要的設備

A. 凝膠過濾層析的凝膠層析的應用

⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質脫鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然後加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。
⑵用於分離提純：凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標准品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鍾成分的洗脫體積，並以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標准曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標准曲線的凝膠柱內洗脫後，根據物質的洗脫體積，在標准曲線上查出它的的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液

B. 血紅蛋白凝膠過濾層析所需儀器、用具、物品和實驗的具體方案

一、實驗目的

1.了解凝膠柱層析的原理及應用；

2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎。

二、實驗原理

凝膠層析：原理與應用

凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

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凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質時，由於流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則後從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測後分段合並相同組分的各管流出物，即等於把分子量不同的物質相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。

分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：

由凝膠床的組成可知，床體積Vt等於外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際佔有體積Vg之和。即

Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi

而Vo和Vi可通過實驗測得：當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大於凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等於外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小於凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等於凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介於凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。

以床體積Vt（等於pr2h）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kav，若以床體積Vt（等於Vo+Vi）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質計算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。

反應原理

凝膠過濾不僅常用做物質的分離，還可以根據需要用某種試劑非常方便地處理某種物質，當該物質流經試劑區時，因為可連續接觸新鮮試劑，因而可以充分發生反應，最後經過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個還原區帶，當血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰化鉀的混合液）流經還原區帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續下移，與緩沖液中的氧分子結合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的後邊。本實驗操作簡便，直觀性強，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗分離效果。

三、實驗材料

1.器材：層析柱，?10×200

2.試劑：

(1) 20mM磷酸二氫鈉

(2) 20mM磷酸氫二鈉

(3) 40mM FeSO4(用時現配)

(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA

(5) 抗凝血（哺乳動物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置於4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個月為宜）

(6) Sephadex G-25

(7) 固體鐵氰化鉀

四、儀器設備

鐵架台、恆流泵

五、實驗步驟

1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）乾粉，浸泡於蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然後傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最後加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，並用pH計校對）。

2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。裝柱長度至少8cm。最後放入略小於層析柱內徑的濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。

3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鍾。注意液面不要低於凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。

4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血於燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使濃度達到5mg/ml。

5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4於小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液完全進入柱床後加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配製，盡可能縮短在空氣中暴露的時間）。

6．上樣 將柱中多餘的液體從底部流出後關閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內。

7．洗脫 用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察並記錄實驗現象。

8．清洗 待所有色帶流出層析柱後，加快流速，繼續清洗層析柱5min

C. 蛋白質純化，凝膠過濾層析填料

首先瓊脂糖凝膠可來以排源除，這是大孔凝膠，用於分子量較大的成分。
我做分子篩用的比較多的柱子都是葡聚糖凝膠凝膠，我的蛋白比你的大，用G50和G100的填料，做的結果都沒什麼問題。
你的蛋白7kD，如果沒有什麼特別的性質（高級結構是球形還是其他的，有無多聚），G50應該可以。如果你不放心，也可以考慮聚丙烯醯胺凝膠，它和葡聚糖凝膠相比更適合於分子量稍小的蛋白，可能更實用於你的實驗。
聚苯乙烯凝膠沒用過，不發表意見。

D. 凝膠過濾層析法加樣是應注意哪些問題

一般分為三個步驟：裝柱、加樣、洗脫淋洗。
裝柱是需要注意的是：【1】垂直放置版 【2】放置產生氣泡權 【3】放置柱分層
加樣時，【1】加樣前打開出口，使展開劑流出，至正好露出凝膠上平面時，立即關閉出口
【2】加樣時，用滴管緩緩沿柱內壁加入柱子
【3】打開柱子得出口，使待分離的樣品進入柱子。
加樣完成後，進行洗脫。

E. 凝膠過濾層析的基本原理

凝膠過濾層析又稱為排阻層析或分子篩方法。其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質各成分按分子大小分開，達到分離的目的。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

F. 凝膠過濾層析的使用方法

⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定後，將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無「紋路」或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡後，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床後，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然後分部收集洗脫液，並對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反復使用，不必特殊處理，並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析後加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。

G. 凝膠過濾技術有哪些具體應用

凝膠過濾色譜法：解析度較高，但是上樣量僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴格的限制。內離子交換色譜法：根容據目的蛋白質表面所含有的氨基酸殘基帶有的凈電荷分離蛋白質，但是解析度沒有凝膠過濾高。親和層析法：根據生物分子的特異性分離目的蛋白，特異性很高，但是配件容易丟失適合含有特異性的標簽的或者抗體。疏水色譜：根據疏水性來分離蛋白質,缺點是有的蛋白質在高鹽中溶解度降低，所以應用范圍受到限制，適合蛋白質表面含有較多疏水性氨基酸殘基的疏水性蛋白質。

H. 凝膠層析分離物質，有什麼優缺點

1. 凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。

2. 2.分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。

3. 3.分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。

4. 4.應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。

5. 5.解析度不高，分離操作較慢。由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對於分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。
   

I. superdex 200，凝膠過濾層析過程中，更換不同的樣品，需要用氫氧化鈉溶液沖洗柱子嗎

不用，只要前一次層析沖干凈後，緊接著下一次層析就可以直接上樣。結束後使用氫氧化鈉沖洗。

J. 凝膠過濾層析的優點

它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，並且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。