大孔吸附樹脂可以提取溶酶菌

Ⅰ 溶菌酶的制備

溶菌酶是採用生物工程技術進行克隆、提取而製取,它是一種天然酶，安全綠色的添加劑，無抗葯性。
該酶廣泛存在於人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最為豐富。從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種129個氨基酸殘基構成的單一肽鏈。它富含鹼性氨基酸，有4對二硫鍵維持酶構型，是一種鹼性蛋白質，其N端為賴氨酸，C端為亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽性菌。
溶菌酶在等電點以下較廣泛的pH值范圍內，分子帶正電荷，可吸附於弱酸性陽離子交換樹脂上，洗脫後鹽析，可得溶菌酶沉澱，再進行精製可得成品。蛋清吸附↓724樹脂洗滌↓緩沖液洗脫↓硫酸銨溶液鹽析透析去鹼性蛋白↓NaOH凍干溶菌酶凍乾粉沉澱乾燥溶菌酶在5～10℃下，將新鮮蛋清540kg加入到已處理好的80kg 724樹脂中，攪拌吸附6h，在0～5℃靜置過夜。傾出上層蛋清，樹脂離心甩干，用蒸餾水反復洗去黏附的卵蛋白，然後將樹脂裝入柱內，用0?15mol/L、pH=6?5磷酸緩沖溶液約150L洗滌樹脂，再用約600L的10%硫酸銨溶液洗脫，收集洗脫液。洗脫液中加硫酸銨，使最終含硫酸銨量為40%，有白色沉澱生成，冷處放置過夜。虹吸上層清液，沉澱吸濾抽干，再用1倍蒸餾水溶解沉澱呈稀糊狀，然後裝入透析袋，在約5℃的條件下，對蒸餾水透析24h左右，中間換水2～3次。離心去除沉澱，沉澱再用少量水洗一次，洗液與離心液合並。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，使pH值上升到8?0～9?0，如有白色沉澱，即離心除去。然後用3mol/L鹽酸調pH=5?0，冷凍乾燥，即得白色片狀溶菌酶。也可將離心液用3mol/L鹽酸調pH=3?5，在攪拌下緩慢加入5%的固體氯化鈉，在約5℃的溫度下靜置48h，離心，沉澱用0℃丙酮洗滌，乾燥，即得溶菌酶。

Ⅱ 溶菌酶含量的測定方法

那要看你用什麼方法測定dna和rna：
（1）紫外吸收法也就是測量od（260）和od（280）的吸收值，這樣的方法其它的雜質對測量結果影響大一點，因為其它雜質在這兩個吸收波長也有吸收。
（2）熒光法，用picogreen熒光染料，測定dna，rna濃度比較靈敏，並且適合測量低濃度和微量dna和rna，並且受其它雜質的影響不大，缺點要有專門的熒光檢測儀器，試劑比較昂貴。
純化dna可以買試劑盒，主要有膜吸附法，磁珠分離法，都很方便。

Ⅲ 在溶菌酶的粗提取實驗中,為什麼將蛋清緩沖液PH調到4.7後又調到8.0

因為卵清蛋白的等電點是4.7，為了提純溶菌酶，要將卵清蛋白沉澱，所以要把PH調到4.7，至於8.0，這是溶菌酶的最適PH值。

提取溶菌酶的方法：
樹脂預處理：干樹脂清水浸泡，使其充分膨脹並除去細小顆粒和較大雜質； 1 mol/L 的HCl浸泡2 h，去離子水洗3次至至近中性；抽濾收集樹脂,1 mol/L 的NaOH溶液浸泡2 h，去離子水洗3次至近中性；抽濾收集樹脂,加0.15 mol/L、pH 值為6．5的磷酸緩沖液平衡過夜待用。
蛋清制備：將3個新鮮雞蛋洗凈乾燥，小端敲一個小洞，大端打一個小孔進氣，分離得雞蛋清，用1 mol/L HCl調節PH到7。過濾前稱量燒杯重48.7g，緩慢攪拌用滅菌的兩層紗布過濾除去臍帶塊和碎蛋殼等，蛋清與燒杯總重207.5g，蛋清凈重158.8g。用1 mol/L 的HCl 溶液調pH 值至7.0，量蛋清體積為100 ml。在調節PH時蛋清中出現少量白色沉澱，可能為部分蛋白由於局部過酸而變性。
吸附：蛋清在不斷攪拌下加入抽濾好的724樹脂25g（相當蛋清四分之一體積的樹脂），冰水浴中磁力攪拌器緩慢攪拌（使樹脂全部懸浮在雞蛋清中，攪拌不能起泡）吸附2.5 h，4℃靜置1.5h。然後3000r/min離心15min分層，收集樹脂，回收蛋清（留樣A）。
去除雜蛋白：收集樹脂用去離子水振盪水洗直至洗液澄清（至無白沫為止），吸管輕吸去洗液，以去除雜蛋白。（每洗1次，離心1次，總共3次）冰浴中用等體積的0.15mol/L、pH =6.5的磷酸緩沖液攪拌洗滌15min，抽濾，重復洗三次，注意防止樹脂流失。最後一次抽濾濾除樹脂水分至乾燥。
洗脫溶菌酶：樹脂中加入35ml（等體積）的10％（NH4）2SO4溶液攪拌洗脫30 min，抽濾,使溶菌酶從樹脂上洗脫下來，重復兩次，合並收集洗脫液（留樣），洗脫液過濾後，准確量取體積100ml。（留樣B）
鹽析:每83mL洗脫液加32g磨細的固體（NH4）2SO4，本實驗中總量為38.55g。緩慢加入（NH4）2SO4攪拌待完全溶解後保鮮膜封口，置於4℃冰箱鹽析過夜。
透析:待白色沉澱析出，3000r/min離心15 min，收集沉澱，用去離子水將沉澱洗下並全部溶解（4.5ml去離子水），裝於透析袋中，於去離子水中透析（冰浴），期間2次更換去離子水，直至用BaCl2檢測透析完全。透析裝置中加入磁子，於磁力攪拌器中攪拌加快透析速度。
去雜質蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl調整pH4.6，產生少量白色沉澱（留樣D），可能為雜蛋白。3000r/min離心10min，收集上清液（留樣C 20ul）。
濃縮：用PEG-20000濃縮上清液至1.5ml（留樣E，20ul，加loading buffer,出現黃色（可能為濃縮時透析袋中滲入了PEG-20000）。[5][6]

Ⅳ 用大孔樹脂，洗脫溶菌酶時用的洗脫劑最適濃度是多少啊，洗脫劑是氯化鈉，硫酸銨

實驗七 溶菌酶的制備及其性質
D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析:
洗脫：用柱平衡液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平後，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，濃度為0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液。
Sephadex G50分子篩柱層析:
洗脫:樣品流完後，先分次加入少量6g/L NaCl洗脫液洗下柱壁上的樣品，連接恆流泵，使流速為0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分鍾一管。

Ⅳ 雞蛋能提取溶菌酶嗎

溶菌酶 溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質酶（muramidase）或N-乙醯胞壁質聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的鹼性酶。主要通過破壞細胞壁中的N-乙醯胞壁酸和N-乙醯氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 該酶廣泛存在於人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最為豐富。從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種129個氨基酸殘基構成的單一肽鏈。它富含鹼性氨基酸，有4對二硫鍵維持酶構型，是一種鹼性蛋白質，其N端為賴氨酸，C端為亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽性菌。 溶菌酶的應用過程中的優點 （1）溶菌酶是很穩定的蛋白質，有較強的抗熱性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐熱的酶； （2）溶菌酶不會因為有機溶劑的處理而失活，當轉移到水溶液中時，溶菌酶的活力可全部恢復； （3）溶菌酶可被冷凍或乾燥處理，且活力穩定； （4）溶菌酶適宜pH5.3~6.4，可用於低酸性食品防腐； （5）溶菌酶生產成本較低； （6）溶菌酶的抗菌譜較廣，不僅局限於G+ 菌，對部分G 菌也有抑制效果； （7）溶菌酶作為防腐劑安全性高。溶菌酶是一種天然蛋白質，1992年FAO/WTO 的食品添加劑協會已經認定溶菌酶在食品中應用是安全的。 溶菌酶的應用 1 醫學上應用 可作為一種具有殺菌作用的天然抗感染物質。有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復功能等作用。臨床用於慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等。也可與抗菌葯物合用治療各種細菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(腸溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、塗擦或直接噴粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。 副作用 偶有較輕的過敏反應。氯化溶菌酶醫療效果更廣，有濃痰分散、出血抑制、組織修復、消炎鎮痛、抗過濾性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制葯有消炎消痔、治感冒、皮膚病及眼、鼻、喉等用葯. 2食品保藏應用 可作為防腐劑,它的主要功用是水解細菌細胞壁，在細胞內，則對吞噬後的病原菌起破壞作用.該酶對革蘭氏陽性菌中的枯草桿菌、耐輻射微球菌有分解作用。對大腸桿菌、普通變形菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性菌也有一定程度溶解作用，其最有效濃度為0.05%。與植酸、聚合磷酸鹽、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。參考資料： http://ke..com/view/39726.htm

Ⅵ 溶菌酶是從哪兒提取出來的

溶菌酶廣泛存在於鳥類、 家禽的蛋清中和哺乳動物的淚液、 唾液、 血漿、 乳汁、 胎盤以及體液、 組織細胞內,其中在蛋清中含量最豐富 (約 0.3% )。在一些植物體如捲心菜、 蘿卜、無花果和微生物體內也存在溶菌酶,只是含量差異較大。
現在還沒有看到可以從玉米中提取處溶菌酶的文獻，最常用的提取原料還是雞蛋清

Ⅶ 質粒的提取原理

質粒提取是指去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

目錄

一、質粒提取原理

質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立於細胞的主染色體之外，質粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經過基因表達後使其宿主細胞表現相應的性狀。在DNA重組中，質粒或經過改造後的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。

從宿主細胞中提取質粒DNA，是DNA重組技術中最基礎的實驗技能。分離質粒DNA有三個步驟：培養細菌使質粒擴增，收集和裂解細菌，分離和純化質粒DNA。

在質粒提取過程中，由於機械力、酸鹼度、試劑等的原因，可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以，多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒：共價閉合環狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂；超螺旋開環DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂；鬆弛的環狀分子線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質粒DNA的分子構型 。

質粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為：鬆弛線性的DNA； 鬆弛開環的OC構型； 超螺旋的SC構型。由於瓊脂糖中加有嵌入型染料溴化乙錠，因此，在紫外線照射下DNA電泳帶成橘黃色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA則位於凝膠的最後邊；道中的L DNA 是經核酸內切限制酶切割質粒之後產生的，它在凝膠中的位置介於OC DNA 和 SC DNA 之間。

二、質粒提取方法

質粒DNA的提取方法主要有鹼裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟據不同的實驗目的和儀器設備擇取不同的實驗方案。

(一) 鹼裂解法：

此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1. 接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2ml LB培養基。

2. 37℃振盪培養過夜。

3. 取1.5ml菌體於Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

6. 加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

7. 以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管

8. 加入等體積的異戊醇，混勻後於0℃靜置10min。

9. 再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10. 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11. 待沉澱乾燥後，溶於0.05mlTE緩沖液中

(二) 煮沸法：

1. 將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2. 棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。

3. 將菌體沉澱懸浮於120ml STET溶液中，渦旋混勻。

4. 加入10ml新配製的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 渦旋振盪3秒鍾。

5. 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。

6. 用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。

7. 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8. 取20ml進行電泳檢查。

(三) 酚氯仿裂解法：

1. 從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標准LB培養液中（含有卡那黴素30 μg/mL）搖菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉澱加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動10 s，混勻；12 000 g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉澱層；上清經國產0。22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振盪10 s，12 000 g/min離心5 min；沉澱溶於20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。

2. 按PstI內切酶說明書進行酶切反應（37℃，1 h）。 酶切產物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

3. PCR引物根據參考文獻〔1〕設計，預計擴增產物片斷大小為714 bp。

4. 常規制備感受態菌E。coli DH5a，提取質粒DNA常規轉化感受態，塗於含有卡那黴素（30 μ/mL）LB培養平板中，37℃培養，15 h後觀察篩選克隆情況。

三、質粒提取常見問題

(一) 溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;2. EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

(二) 溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：1. 溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。2. 解聚細胞中的核蛋白。3. SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

(三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，後者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用後，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉澱更完全。

(四) 為什麼用無水乙醇沉澱DNA？

用無水乙醇沉澱DNA，這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉澱劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量佔67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉澱時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最後的沉澱步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA。一般在室溫下放置15－30分鍾即可。

(五) 在用乙醇沉澱DNA時，為什麼一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易於互相聚合而形成DNA鈉鹽沉澱，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉澱不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉澱的DNA中，由於過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉澱。

(六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸後，為什麼再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉澱，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉澱更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉澱，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

(七) 為什麼在保存或抽提DNA過程中，一般採用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉澱；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，採用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由於緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都採用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

(八) 如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉澱DNA？

採用PEG（6000）沉澱DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉澱DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉澱4.3kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉澱DNA的解析度大約100bp。

(九) 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽提後的水相中有殘留的酚，由於酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

(十) 為什麼用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振盪容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般採用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可採用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配製，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助於分相，使離心後的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。

(十一) 為什麼要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或鹼性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，並在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和後的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取後迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

(十二) 未提出質粒或質粒得率較低？

1. 大腸桿菌老化

請塗布平板培養後，重新挑選新菌落進行液體培養。

2. 質粒拷貝數低

由於低使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷

貝數載體。

3. 菌體中無質粒

有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接後有可能造成質粒丟失。

例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時

應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4. 鹼裂解不充分

使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能

有助於增加質粒提取量和質粒質量。

5. 溶液使用不當

溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置於37℃保溫片刻直至溶解為清亮的

溶液，才能使用。

6. 吸附柱過載

不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若

用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高

的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液體積。

7. 質粒未全部溶解（尤其質粒較大時）

洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

8. 乙醇殘留

漂洗液洗滌後應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗後應晾乾樹脂，再加

入洗脫緩沖液。

9. 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫

效率。

10. 洗脫液不合適

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)

或水。洗脫效率取決於pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保

其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫

緩沖液加熱至60℃後使用有利於提高洗脫效率。

11. 洗脫體積太小

洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降

低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12. 洗脫時間過短

洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鍾可達到較好的效果。

(十三) 質粒純度不高？

1. 混有蛋白

不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理並離心後溶液應為澄清的，如果還混有

微小蛋白懸浮物，可再次離心去除後再進行下一步驟。

2. 混有RNA

RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之後室溫放置一段時間。如

果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNase A。

3. 混有基因組DNA

加入溶液P2和P3後應溫和混勻，如果劇烈振盪，可能把基因組DNA剪切成碎片從

而混雜在質粒中。如果加入溶液P2後過於粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用

量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，不要超過16 小時。

4. P3溶液加入時間過長

P3溶液加入後，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完

整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

6. 裂解時間過長

加入溶液P2後裂解時間不應超過5分鍾。

7. 質粒的二聚體和多聚體形式

質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。

Ⅷ 停止溶菌酶酶解處理需要加什麼呢

溶菌酶既然是蛋白質,過高的pH和低於8的pH下都會被抑制,強離子濃度時也會被抑制,加熱或者加入SDS也會失活.
在提取質粒過程中,對於難以裂解的細胞會加入溶菌酶,但這一步一定要先加,然後再加P2裂解,因為P2裡面的SDS等會使溶菌酶失活.